Optimización y validación analítica de una técnica de reacción en cadena de lapolimerasa seguida de análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos derestricción para factor V de Leiden y protrombina G20210A

Resumen

La trombofilia hereditaria es un factor predisponente para la enfermedad tromboembólica venosa, frecuentemente asociada a los polimorfismos factor V de Leiden (G1691A) y protrombina G20210A. La identificación molecular de estas variantes resulta clave para la estratificación del riesgo y la implementación de estrategias profilácticas. El objetivo de este trabajo fue optimizar y validar un método in house, basado en la reacción en cadena de la polimerasa seguida de análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (PCR-RFLP) para la identificación de ambos polimorfismos. Se realizó una reacción en cadena de la polimerasa in silico para evaluar la especificidad de los cebadores, seguida de la optimización de las condiciones de amplificación mediante gradiente térmico. Los productos amplificados se sometieron a digestión enzimática con Mnl I y Hind III y a posterior análisis por electroforesis en gel de agarosa. La validación incluyó sensibilidad y especificidad analítica, exactitud (mediante secuenciación de Sanger), veracidad, interferencias, robustez y precisión. Se obtuvieron amplicones específicos de 267 pb para factor V y 506 pb para protrombina con temperaturas óptimas de hibridación de 58 °C y 59 °C. El método presentó sensibilidad y especificidad del 100%, con concordancia total respecto de un laboratorio externo y la secuenciación. No se detectaron interferencias, y los ensayos mostraron alta repetibilidad y reproducibilidad. En conclusión, la técnica optimizada constituye una herramienta rápida, precisa, robusta y de bajo costo para la detección de estos polimorfismos que favorece la identificación de individuos con predisposición genética a eventos trombóticos.