12  
Nueva pueba diagnóstica para anticuerpos en Miastenia Gravis basado en un sistema  
de micropartículas fluorescentes libre de células  
ARTÍCULO ORIGINAL  
Nueva prueba diagnóstica para autoanticuerpos en  
Miastenia Gravis basado en un sistema de micropartículas  
fluorescentes libre de células  
2
1
,2  
1
1,2  
3
3
Paz, Mariela Laura ; Manuelli, Paula Natalia ; González Maglio, Daniel Horacio ; Aguirre, Florencia ; Villa, Andrés ; Leoni, Juliana ;  
4
Barrantes, Francisco José.  
1
Laboratorio de Inmunología Básica, Aplicada y Patológica, Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología, Cátedra de  
Inmunología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, CABA, Argentina.  
2
CONICET-Universidad de Buenos Aires, CABA, Argentina.  
3
Sección de Neuroinmunología y Electrofisiología, División Neurología, Hospital Ramos Mejía, CABA, Argentina.  
4
Laboratorio de Neurobiología Molecular, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Facultad de Ciencias Médicas, UCA-CONICET,  
CABA, Argentina.  
Dirección de correspondencia: marielaurapaz@gmail.com  
Resumen  
Introducción: Se ha desarrollado una novedosa prueba diagnóstica para la detección de autoanticuerpos  
en pacientes con miastenia gravis. Este nuevo método, libre de células, es relativamente simple y consume  
menos tiempo y materiales que el radioinmunoensayo estándar, método de referencia utilizado actualmente  
en la clínica. Materiales y métodos: La prueba consiste en el uso de micropartículas de poliestireno recubier-  
tas con el receptor de acetilcolina (se probaron dos fuentes de receptor de diferente origen), marcación es-  
pecífica del receptor con ligandos fluorescentes de alta afinidad (α-bungarotoxina-AlexaFluor o anticuerpos  
anti-receptor policlonales provenientes de los sueros de pacientes diagnosticados con la enfermedad, segui-  
dos de anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromos), y detección por citometría de flujo. Resulta-  
dos: Los valores de intensidad de fluorescencia media para los sueros positivos por la técnica de referencia  
versus un pool de sueros humanos normales: mostraron una diferencia estadísticamente significativa para  
los dos tipos de micropartículas sensibilizadas utilizadas. Conclusión: Las dos estrategias diferentes eva-  
luadas fueron exitosas para la detección de autoanticuerpos en el suero de pacientes con miastenia gravis.  
Adicionalmente esta prueba tiene el potencial para distinguir entre las distintas formas de los anticuerpos  
anti-receptor de acetilcolina, y los resultados podrían correlacionarse con la severidad de la miastenia gra-  
vis, pudiendo resultar un elemento predictivo de gran utilidad en el seguimiento de la evolución clínica de la  
enfermedad.  
Palabras clave: receptor de acetilcolina, anticuerpos anti-receptor de acetilcolina, citometría de flujo, mi-  
cropartículas, miastenia gravis.  
Abstract  
Introduction: A new diagnostic test for the detection of autoantibodies for myasthenia gravis was deve-  
loped. The new cell-free test is relatively simple and less time- and material-consuming than the standard  
radioimmunoassay-based methodologies in current clinical practice. Materials and methods: The test invol-  
ves the use of polystyrene microbeads coated with the nicotinic acetylcholine receptor protein (two different  
sources of the receptor were tested), specific labeling of the protein with high-affinity fluorescent ligands  
(AlexaFluor-α-bungarotoxin or polyclonal anti-receptor antibodies from sera of already diagnosed patients,  
followed by secondary fluorescent-labeled antibodies), and detection by fluorescence flow cytometry. Re-  
sults: mean fluorescence intensity for positive sera versus a pool of human normal sera: showed statistically  
significant differences for the two receptor´s source types used. Conclusion: The two different approaches  
tested were successful for the detection of autoantibodies in sera from patients with myasthenia gravis. The  
new test has the potentiality to distinguish between different autoantibody isoforms and subtypes, and the  
results may be correlated with the severity of myasthenia. The test may be eventually applied to predict the  
clinical evolution of this pathology.  
ISSN 1515-6761 Ed. Impresa  
ISSN 2250-5903 Ed. CD-ROM  
Código Bibliográfico: RByPC  
Fecha de aceptación:  
Key words: acetylcholine receptor, anti-acetylcholine receptor autoantibodies, flow cytometry, micro-  
beads, myasthenia gravis.  
1
9/09/2017  
Fecha de recepción:  
1/07/2018  
3
ByPC 2018;82(3):12-17.  
Nueva pueba diagnóstica para anticuerpos en Miastenia Gravis basado en un sistema  
13  
de micropartículas fluorescentes libre de células  
Introducción  
fuentes diferentes de receptor fueron evaluadas: nAChR  
La miastenia gravis (MG) es una enfermedad autoinmune del órgano eléctrico de Torpedo califórnica (Tc, Aquatic Re-  
mediada por autoanticuerpos patogénicos (ACRA) dirigidos search Consultants) purificado por cromatografía de afini-  
contra el receptor acetilcolina nicotínico (nAChR), la cual se ma- dad [9,10]; y nAChR de un extracto de músculo bovino (Bm)  
nifiesta clínicamente con debilidad muscular [1,2]. La técnica purificado por cromatografía de intercambio iónico [11,12].  
actual de referencia para detectar ACRA es el radioinmunoensa-  
Para la preparación de las micropartículas sensibilizadas  
yo (RIA), un método costoso y nocivo para el medioambiente. se mezclaron 1,4 μl de micropartículas de poliestireno (1  
2
6
Se han realizado intentos para sustituir al RIA con ensayos de cm o 2 x 10 partículas) con 2,3 μl de nAChR de Tc (0,6 μg)  
inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), pero, hasta el mo- o 1 μl de Bm (0,7 μg), en un volumen final de 20 μl en buffer  
mento, no se ha podido alcanzar la alta sensibilidad que posee isotónico salino (IBS) (2,3 mM NaH PO ; 14,2 mM Na HPO ;  
2
4
2
4
el RIA [3,4].  
140 mM NaCl; 3,8 mM KCl), y se incubaron durante 16 hs a  
El objetivo principal de este trabajo fue desarrollar un méto- 4 °C en un agitador orbital. La mezcla luego fue centrifugada  
do alternativo, simple y ecológicamente amigable, para la me- a 5.000 x g por 10 min y el sobrenadante fue descartado.  
dición de ACRA. La metodología se basa en la inmovilización del El pellet fue resuspendido en 20 μl de IBS-BSA (0,5 % p/v  
nAChR en partículas de poliestireno, su interacción con sondas seroalbúmina bovina en IBS) y la suspensión incubada por  
fluorescentes y su detección por citometría de flujo.  
1 h a temperatura ambiente en un agitador orbital, con el  
El nAChR es un canal iónico pentamérico regulado por ligando objetivo de bloquear todos los sitios libres no sensibilizados  
con dos isoformas: la neuronal y la muscular. La última está con- con el receptor. La preparación fue centrifugada a 5.000 x  
formada por tres cadenas diferentes (β, δ, γo ε) y dos cadenas g por 10 min nuevamente, el sobrenadante fue descartado  
α idénticas, las cuales poseen el sitio de unión a los ligandos y el pellet resuspendido en 20 μl de IBS (resultando en una  
5
[
5]. El ligando natural del receptor es la acetilcolina, pero las suspensión de 1 x 10 micropartículas-nAChR por μl). La  
subunidades alfa pueden también unir antagonistas, como la suspensión se almacenó a 4 °C hasta su uso.  
neurotoxina altamente específica derivada de un veneno de ví-  
bora, denominada α-bungarotoxina (BTX) [6,7]. Los pacientes Microscopía de Fluorescencia  
con MG poseen autoanticuerpos anti-receptor de acetilcolina  
ACRA) que son los marcadores serológicos de la enfermedad dos intensamente y secados [13]. Luego los mismos fue-  
1]. Existen tres tipos de ACRA: de unión, bloqueantes y modula- ron recubiertos con una solución de polilisina (0,1 mg/mL)  
Cubreobjetos de vidrio de 15 mm No. 1,5 fueron limpia-  
(
[
dores. Los primeros pueden unirse a cualquier sitio del receptor, por 5 min a temperatura ambiente y el exceso de solución  
los segundos se unen al sitio de unión a ligandos en la interface se dejó escurrir y secar totalmente.  
4
de la subunidad α con una subunidad no-α, y el tercer tipo no  
Las micropartículas (1x10 ) sensibilizadas con nAChR de  
sólo es capaz de unirse al nAChR, sino que además desencade- Tc o músculo bovino respectivamente, fueron colocadas so-  
na su internalización y reciclado [8]. bre los cubreobjetos recubiertos con polilisina, permitiendo  
El objetivo a largo plazo de este desarrollo es poder detectar su inmovilización durante 16 hs a 4 °C. Todas las incubacio-  
de manera simultánea y en un mismo ensayo los ACRA de unión nes fueron realizadas en cámara húmeda. Los cubreobjetos  
y bloqueantes, utilizando sondas fluorescentes con diferente fueron luego lavados e incubados con los siguientes ligan-  
longitud de onda de emisión para distinguirlos.  
dos fluorescentes por 1h a temperatura ambiente: i) α-BTX-  
488 555  
AlexaFluor (1 μM, Invitrogen), ii) α-BTX-AlexaFluor (1  
μM, Invitrogen) y iii) un suero ACRA positivo de un paciente  
diagnosticado con MG, como anticuerpo primario (suero A,  
Materiales y Métodos  
Pacientes  
Las muestras de suero de pacientes y de voluntarios 1:100, valor ACRA por RIA 3,71 nmoles/l). En el último caso  
sanos se obtuvieron del Servicio de Neuroinmunología del fueron realizados dos lavados con buffer fosfato salino  
Hospital Ramos Mejía, Consultorio de Miastenia Gravis, Bue- (PBS) antes del agregado del anticuerpo secundario anti-  
nos Aires, Argentina. Todos los estudios se llevaron a cabo Igs humanas-FITC (1:200, Bethyl), con 1 h de incubación a  
bajo un protocolo aprobado por el Comité de Ética de dicho temperatura ambiente en oscuridad. Luego de dos lavados  
Hospital y todas las muestras se obtuvieron con un consen- más con PBS. Los cubreobjetos se montaron en cámaras de  
timiento informado firmado por los individuos involucrados. perfusión especialmente diseñadas, se agregó PBS y final-  
El estudio se llevó a cabo de acuerdo con los estándares mente la fluorescencia fue observada en un microscopio  
éticos declarados en el Código de Ética de la Declaración de de epifluorescencia hecho a medida. Este microscopio fue  
Helsinki de 1964.  
construido por uno de los grupos de trabajo (F.J. Barrantes),  
y funciona actualmente en el laboratorio de Neurobiología  
Molecular a su cargo. Dicho microscopio, el primero de su  
Sensibilización de micropartículas  
El primer paso del procedimiento de esta nueva técnica tipo en el país, opera en epifluorescencia de campo ancho,  
analítica consistió en recubrir (sensibilizar) la superficie de microscopía estocástica de molécula única (STORM) y de  
micropartículas de poliestireno de 4 μm (Spherotech, Inc) fotoactivación (PALM) en super-resolución. Las imágenes  
2
con el nAChR (70 μg / 100 cm de micropartículas). Dos fueron adquiridas utilizando un objetivo de inmersión 100  
ByPC 2018;82(3):12-17.  
14  
Nueva pueba diagnóstica para anticuerpos en Miastenia Gravis basado en un sistema  
de micropartículas fluorescentes libre de células  
X de 1,49 N.A. (Nikon) bajo una iluminación con diodos de tículas de poliestireno sensibilizadas se mezclaron con el  
emisión de luz (LED) (Tolket, Argentina), utilizando el pa- volumen apropiado de cada sonda fluorescente primaria y se  
quete de software de imágenes SlideBook (Intelligent Ima- incubaron durante 16 hs a 4 ° C en un agitador orbital en un  
ging Innovations).  
volumen final de 50 μl. Después, las suspensiones fueron la-  
vadas dos veces con PBS utilizando un equipo que consta de  
placas de 96 pocillos y su correspondiente sistema de vacío  
Citometría de Flujo  
En otra serie de experimentos, las micropartículas sensibi- (MultiScreenHTS, Millipore). Cada suspensión - muestra se co-  
lizadas con nAChR de Tc o músculo bovino respectivamente, loca en un pocillo, donde cada pocillo posee un filtro de PVDF  
fueron marcadas en solución y sometidas a una citometría de 0,45 μm, a continuación se aplica vacío, eliminándose de  
de flujo utilizando un citómetro PAS III PARTEC. Brevemente, este modo la porción líquida de la suspensión y quedando  
5
cada tubo conteniendo 1 x 10 micropartículas sensibilizadas retenidas las micropartículas. De este modo pueden realizar-  
488  
fue incubado con α-BTX-AlexaFluor (1 μM) o diferentes se varios lavados de manera muy sencilla y rápida, evitando  
sueros humanos normales (SHN, 1:50) o diferentes sueros los pasos de centrifugación con su consecuente pérdida de  
ACRA + (1:50) y anticuerpos secundarios-FITC (1:100). Debe material. Las micropartículas fueron resuspendidas adicio-  
mencionarse que los sueros ACRA + evaluados de pacien- nando 20 μl de PBS a cada pocillo y luego incubadas con los  
tes con MG (n = 5, A a E) fueron previamente valorados por anticuerpos secundarios por 1 h a temperatura ambiente en  
RIA, y clasificados como ACRA + (> 0,5 nmol/l). Lo mismo se un agitador orbital (100 rpm), en el caso que correspondiese.  
realizó para las muestras de SHN (n = 5), que resultaron ser Las micropartículas fueron lavadas tres veces con PBS, re-  
todas negativas por RIA (< 0,1 nmol/l) y luego, también, por suspendidas en 100 μl de PBS y sometidas a la citometría de  
citometría de flujo. Posteriormente, se juntaron alícuotas de flujo. Alrededor de 20.000 eventos se registraron para cada  
cada uno de ellos para conformar un pool negativo, para su condición. La Intensidad de Fluorescencia Media (IFM) fue  
uso futuro y se le midió nuevamente su valor de ACRA por RIA, calculada para cada muestra (incluyendo el control de auto-  
resultando también negativo (< 0,1 nmol/L).  
fluorescencia, conteniendo sólo micropartículas sensibiliza-  
Para el ensayo de citometría de flujo, 1 μl de las micropar- das sin marcar).  
Figura 1.Imágenes de microscopía de fluorescencia mostrando las micropartículas sensibilizadas con nAChR-Tc, incubadas con a)  
α-BTX-AlexaFluor5 y c) suero del paciente A con MG, ACRA+. Las micropartículas sensibilizadas con nAChR-Bm, incubadas con b)  
α-BTX-AlexaFluor4 y d) suero del paciente A con MG, ACRA+.  
55  
88  
ByPC 2018;82(3):12-17.