Efecto de la inhalación de las partículas aéreas de la Ciudad de Buenos Aires: alteraciones histomorfológicas, metabólicas y bioquímicas

a nivel pulmonar y extrapulmonar en ratones jóvenes y adultos mayores

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ARTÍCULO ORIGINAL

Efecto de la inhalación de las partículas aéreas de la

Ciudad de Buenos Aires: alteraciones histomorfológicas,

metabólicas y bioquímicas a nivel pulmonar y

extrapulmonar en ratones jóvenes y adultos mayores

Orona, Nadia Soledad ; Astort, Francisco ; Ferraro, Sebastián Ariel ; Maglione, Guillermo Alberto ; Kurtz, Melisa¹^,²; Agos-

1

,2*

1,2

3

1

3

4

1,3

ta, Eduardo Germán ; Mandalunis, Patricia Mónica ; Morales, Celina ; Tasat, Deborah Ruth

¹Laboratorio de Biología Celular del Pulmón, Centro de estudios en Salud y Medio Ambiente, Escuela de Ciencia y Tecnología,

Universidad Nacional de San Martín. Buenos Aires, Argentina.

2

Consejo Nacional de Investigaciones Cientíﬁcas y Tecnológicas (CONICET).

3

Cátedra de Histología y Embriología Humana, Facultad de Odontología, Universidad de Buenos Aires. CABA, Argentina.

4

Instituto de Fisiopatología Cardiovascular, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires. CABA, Argentina.

Contacto: Orona, Nadia Soledad, Escuela de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de San Martín, Martín de Irigoyen

3100, (1653) San Martín, Buenos Aires, Argentina; naorona@gmail.com

Resumen

Introducción: numerosos estudios han demostrado que la contaminación del aire se asocia a efec-

tos adversos para la salud. Especíﬁcamente, datos epidemiológicos muestran asociación entre la ex-

posición al material particulado aéreo (MP) e incrementos en la morbi-mortalidad por enfermedades

cardiopulmonares. Las partículas de menor tamaño pueden ser traslocadas desde los pulmones a la

circulación y afectar órganos extrapulmonares como corazón e hígado. Sin embargo, el MP no afecta

de igual manera a todas las personas, puesto que la edad es un parámetro que puede inﬂuir en los

efectos del MP sobre la salud. Objetivo: estudiar in vivo, en dos poblaciones etarias (ratones jóvenes

y envejecidos) los mecanismos biológicos mediante los cuales las partículas aéreas de la Ciudad

de Buenos Aires (UAP-BA) podrían inducir efectos adversos en el sistema respiratorio y en órganos

extrapulmonares. Materiales y Métodos: se emplearon ratones BALB/c jóvenes (3 meses de edad)

o envejecidos (9 meses de edad) y se expusieron mediante instilación intranasal a UAP-BA o ROFA

(sucedáneo de la contaminación aérea). Se analizó la respuesta biológica en pulmón, corazón e híga-

do a nivel metabólico (parámetros oxidativos e inﬂamatorios), bioquímico (biomarcadores séricos) e

histomorfológicos a las 3, 24 y 48 hs post-instilación. Resultados: ambos MP provocaron una respues-

ta inﬂamatoria local y sistémica. En el pulmón, histológicamente se observó una reducción del área

alveolar, en el corazón inﬂamación epicárdica y en el hígado inﬂamación y esteatosis con aumento

en los niveles de enzimas transaminasas séricas en ambos grupos etarios. Conclusión: se demostró

que UAP-BA, en un modelo experimental murino, altera no sólo el sistema respiratorio sino también

órganos extrapulmonares como corazón e hígado. Por ello, se hipotetizó que UAP-BA podría potencial-

mente provocar una respuesta biológica adversa similar en individuos jóvenes y adultos que habitan

la Ciudad de Buenos Aires.

Palabras Clave: contaminación ambiental aérea urbana, pulmón, corazón, hígado, inﬂamación, me-

tabolismo oxidativo.

Abstract

Introduction: Numerous studies have shown that air pollution is consistently associated with ad-

verse health effects. Epidemiological data have speciﬁcally shown an association between the expo-

sure to air particulate matter (PM) and an increase in cardiorespiratory morbidity/mortality. Smaller

particles can be translocated from the lungs into the circulation and affect extrapulmonary organs

such as the heart and liver. However, PM does not equally impact all the population, since the effects

of MP on health may be inﬂuenced by age. Objective: to study in vivo the biological mechanisms by

which Buenos Aires Urban Air Particles (UAP-BA) could induce adverse effects on the respiratory sys-

tem and extrapulmonary organs of young and adult mice. Materials and Methods: young (3 months

ISSN 1515-6761 Ed. Impresa

ISSN 2250-5903 Ed. CD-ROM

Código Bibliográﬁco: RByPC

Fecha de recepción:

2/9/17

Fecha de aceptación:

8/4/18

1

2

ByPC 2018;82(1):45-58.

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old) and adult (9 months old) BALB/c mice were exposed to UAP-BA or ROFA (surrogate of airborne

contamination) by intranasal instillation. In the lung, heart and liver, the biological response was as-

sessed metabolically (oxidative and inﬂammatory parameters), biochemically (serum biomarkers),

and histomorphologically at 3, 24 and 48 h post-instillation. Results: both types of PM caused local

and systemic inﬂammatory response. Histologically, we observed a reduction of the alveolar area in

the lung, heart epicardial inﬂammation, and liver inﬂammation and steatosis with an increase in the

levels of serum transaminases in both age groups. Conclusions: we showed in a murine experimental

model that UAP-BA altered not only the respiratory system but also extrapulmonary organs such as

the heart and liver. Therefore, we hypothesized that UAP-BA could potentially induce similar adverse

biological effects on young and adult individuals living in the City of Buenos Aires.

Key words: urban air pollution, lung, heart, liver inﬂammation, oxidative metabolism.

Introducción

de personas mayores de 60 años más alto de nuestro país,

La contaminación atmosférica es una mezcla heterogé- alcanzando un 16,4 %. Por lo tanto, el impacto de factores

nea de gases, líquidos y material particulado (MP). Estudios ambientales, como la contaminación aérea en la población

epidemiológicos han mostrado que, en las grandes ciuda- envejecida crece en importancia [23].

des, existe una correlación positiva entre la calidad del aire

En este contexto, el objetivo de este trabajo es estudiar

y la salud de sus habitantes [1-4]. Estos estudios muestran in vivo en dos poblaciones etarias diferentes (ratones jó-

asociación entre los niveles de MP y la morbo-mortalidad venes y adultos mayores) los mecanismos biológicos, me-

por enfermedades respiratorias y cardiovasculares [5-10]. diante los cuales las partículas aéreas urbanas de Buenos

El efecto del MP depende de su tamaño y composición Aires (UAP-BA) podrían inducir efectos adversos en el sis-

ﬁsicoquímica. Cuanto menor es el tamaño del MP, mayor tema respiratorio y en órganos extrapulmonares. Para ello,

es su reactividad y posible toxicidad [11]. Las partículas se analizó la respuesta en pulmón, corazón e hígado a la

aéreas ﬁnas (MP₂_,₅) y ultraﬁnas (MP₀_.₁) pueden impactar exposición de UAP-BA y un sucedáneo de la contaminación

directa y localmente a nivel pulmonar o traslocar e impac- ambiental aérea ROFA (por sus siglas en inglés-Residual Oil

tar en órganos a distancia como corazón e hígado [12,13]. Fly Ash) a nivel metabólico (parámetros oxidativos e inﬂa-

Asimismo, estas partículas ejercen un efecto indirecto y sis- matorios), bioquímico (biomarcadores séricos) e histomor-

témico a través de mediadores oxidativos y/ o inﬂamatorios fológico.

generados a nivel pulmonar.

En el año 2012, la Organización Mundial de la Salud Materiales y Métodos

(

OMS) estimó que la contaminación atmosférica en las ciu- Animales

dades y zonas rurales de todo el mundo provoca cada año Se utilizaron ratones BALB/c machos jóvenes (1 - 3 me-

,7 millones de defunciones prematuras, consecuencia ses) y envejecidos (10 - 12 meses) provenientes del bio-

3

principalmente de la exposición al MP, el cual puede impac- terio de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la

tar en distintos tejidos del organismo causando principal- Universidad de Buenos Aires. Los animales se mantuvieron

mente asma, bronquitis crónica, arritmia cardíaca, ataques en condiciones estándares recibiendo agua y comida ad li-

cardíacos y cáncer.

bitum con un ciclo 12:12 horas luz-oscuridad y temperatura

La Ciudad Autónoma de Buenos Aires (CABA), es una me- ambiente controlada de 22 - 24°C, en el bioterio del Centro

gaciudad con 2.8 millones de habitantes [14], en la que se de Salud y Medio Ambiente, Escuela de Ciencia y Tecnología

ha identiﬁcado que la fuente primaria de contaminación aé- de la Universidad Nacional de San Martín. Para el uso y cui-

rea es la emisión vehicular, siendo esta responsable de más dado de animales de laboratorio se siguieron las directivas

del 90 % de la contaminación ambiental de la ciudad [15]. del NIH (National Institute of Health) [24], los lineamientos

Previamente, este grupo de trabajo [16] ha encontrado que de la Universidad Nacional de San Martín (UNSAM) y la nor-

en ciertas ocasiones el MP₂_,₅de la ciudad de Buenos Aires mativa de referencia para Bioterios: Disposición Nº6344/96

(UAP-BA) excede los valores estándares establecidos por de la Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos

la agencia de protección ambiental de los Estados Unidos y Tecnología Médica (ANMAT).

(

EPA) y por la OMS [17,18].

Si bien el MP afecta a toda la población, la susceptibilidad

Recolección y caracterización del material particulado

(UAP-BA y ROFA)

a la contaminación puede variar con la salud o la edad de los

individuos. En este sentido, se identiﬁcan a los lactantes, los

mayores de 65 años (adultos mayores) y los individuos con

fallas cardiorrespiratorias previas como subpoblaciones de

riesgo [19-22]. Demográﬁcamente, CABA presenta el índice

Las partículas Aéreas Urbanas de la Ciudad de Buenos Ai-

res (UAP-BA) se recolectaron en la zona de Villa del Parque,

Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina, caracterizada

por un alto tránsito vehicular principalmente de automóvi-

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les y colectivos [25]. Para el muestreo de UAP-BA se utilizó sistema de captura de imágenes (Leica Microsystems AG,

un Mini Vol sampler (Airmetrics, Eugene, OR, USA) de ﬂujo Alemania).

1,8 L/min en ﬁltros de teﬂón (47 mm, Sartorius, 0,2 um).

La severidad de la lesión en el corazón fue evaluada se-

Los ﬁltros se pesaron (luego de equilibrar su humedad) an- gún los criterios semicuantitativos establecidos por Her-

tes y después de recolectar las partículas para determinar man [31]. Este sistema de clasiﬁcación se basa en el por-

su peso neto, empleando una micro balanza (Mettler M3, centaje de cardiomiocitos que muestran pérdida mioﬁbrilar,

precisión de 1 μg), que utiliza una fuente Alfa para remover vacuolización citoplasmática e inﬁltrado inﬂamatorio:

la carga electrostática.

• Grado 0 = no hay daño;

Las partículas provenientes del residuo volátil de la que- • Grado 1 = < 5 %;

ma de petróleo, ROFA (Por sus siglas en inglés -Residual Oil • Grado 1,5 = 5 - 15 %;

Fly Ash-) se recolectaron en la planta industrial petrolífera • Grado 2 = 16 – 25 %;

de Mystic River, Everett, MA, USA y son una donación del Dr. • Grado 2,5 = 26 – 35 %;

J. Godleski, de la Escuela de Salud Pública de Harvard, Bos-

ton, MA, USA. Estas partículas son ampliamente utilizadas

•

Grado 3 = > 35 %.

El análisis histopatológico se llevó a cabo en el ventrículo

en toxicología ambiental como análogas de material parti- izquierdo, ventrículo derecho, septum y células mesotelia-

culado ambiental aéreo [25-28].

les del epicardio.

El análisis morfológico de las partículas se realizó me-

La gravedad de la lesión hepática fue evaluada tomando

diante microscopia electrónica de barrido (MEB), em- como base los criterios semicuantitativos descritos para la

pleando un microscopio SEM Philips 515. El análisis de la esteatohepatitis no alcohólica [32]. Este sistema de clasiﬁ-

composición química elemental se realizó mediante espec- cación se basa en la esteatosis, lesión de los hepatocitos e

troscopía dispersiva de rayos X (EDX 4100, detector Si/Li y inﬂamación lobular.

ventana de Be).

Parámetros inﬂamatorios

Diseño experimental: Modelo de exposición agudo a las par-

tículas ambientales (UAP-BA y ROFA)

1

. Lavado bronqueo alveolar (BAL): La técnica del BAL

empleada fue desarrollada por Brain [33] y modiﬁcada

por Tasat y De Rey [34]. A brevedad, se practicó la euta-

nasia de los animales mediante una sobredosis de Clor-

hidrato de Ketamina (Holliday-Scott S.A., Buenos Aires,

Argentina) por vía intraperitoneal e inmediatamente se

expuso, canuló y perfundió la tráquea con 1 ml de PBS

Animales, jóvenes o envejecidos, se anestesiaron por vía

intraperitoneal (ip) con Xilazina 2 % / Ketamina 50 mg/ml

en solución salina (1 ml/Kg de peso corporal), y se instila-

ron por vía intranasal [29] con una única dosis de 50 μl, por

goteo en ambos oriﬁcios nasales, de una de suspensión de

UAP-BA, ROFA o solución vehículo. Los animales se dividie-

ron aleatoriamente en tres grupos:

1

X (frío, libre de Ca y Mg, pH 7,2 – 7,4). Con el ﬁn de ob-

tener una cantidad óptima de células, el lavado con PBS

X se repitió 12 veces. La suspensión celular se centri-

•

Grupo ROFA (n = 15): se instilaron con una suspensión de

ROFA (1 mg/kg de peso corporal) en Buffer Fosfato Salino

estéril (PBS, 1X, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) [30].

Grupo UAP-BA (n = 15): se instilaron con una suspensión

de UAP-BA en PBS 1X (1mg/kg de peso corporal) [25].

Grupo CONTROL (n = 15): se instilaron con un volumen

equivalente de PBS 1X utilizado como vehículo en las

suspensiones de las partículas.

1

fugó durante 10 minutos a 800xg a 4°C y el precipitado

celular se resuspendió en 1 ml de PBS 1X.

•

2

. Recuento celular total y diferencial: El recuento de cé-

lulas totales obtenidas en el BAL se realizó en cámara

de Neubauer. El recuento celular diferencial se evaluó

5

sobre extendidos celulares (0,5 - 1 x 10 células), los

que se ﬁjaron en metanol (10 minutos) y se colorearon

con Hematoxilina-Eosina, para poder distinguir las dife-

rentes subpoblaciones celulares: Macrófagos Alveola-

res (MA), Polimorfonucleares (PMN) y Linfocitos (LIN).

El número de MA, PMN o LIN se informó como porcentaje

del número celular total.

La eutanasia de los animales se realizó a las 3, 24 o 48 hs

luego de ﬁnalizado el protocolo de exposición. La respuesta

biológica se analizó en los tres grupos experimentales me-

diante los siguientes parámetros: 1) inﬂamatorios, 2) oxi-

dativos, 3) histológicos y 4) bioquímicos.

3

. Determinación de la citoquina proinﬂamatoria IL-6: La

determinación a nivel sistémico de la citoquina IL-6 en

el suero de los animales se realizó mediante la técnica

de ELISA (por sus siglas en inglés -enzyme-linked im-

munosorbent assay) (BD Pharmingen, San Diego, USA).

En una placa de 96 pocillos se adicionó el anticuerpo de

captura contra la citoquina (1 / 250 en carbonato de so-

dio 0,1 M pH 9,5), durante 12-14 horas a 4ºC. Luego se

lavó con buffer de lavado (PBS 1X - 0,05 % Tween 20)

Análisis histológico de los tejidos

Se resecaron el pulmón, corazón e hígado de los ratones

controles y expuestos al MP, se ﬁjaron en formol (10 %) por

no más de 48 horas y se incluyeron en paraﬁna. Se corta-

ron secciones de entre 5 y 7 μm de espesor (micrótomo

Reichert-Jung, Nossloch, Alemania) y se colorearon con He-

matoxilina y Eosina para evaluar los cambios histológicos

generales e identiﬁcar los tipos celulares en los inﬁltrados

inﬂamatorios. Los cortes se observaron en microscopio con

(

Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) y se bloqueó por 1 hora

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con buffer de bloqueo 10 % Suero Fetal Bovino (SFB) en de la adrenalina en ausencia o presencia de las muestras

PBS 1X. Posteriormente, la placa se lavó y las muestras [36]. La actividad relativa de la SOD se calculó como la ca-

y la citoquina patrón se sembraron e incubaron duran- pacidad de esta de inhibir la tasa de oxidación de la adre-

te 2 horas. El anticuerpo de detección biotinilado (1 / nalina, y los resultados se expresaron como unidades de

2

1

50 en buffer de bloqueo) se agregó e incubó durante actividad SOD por mg de proteínas [37].

hora. Nuevamente se lavó, adicionó estreptoavidina

conjugada a peroxidasa y luego de 30 minutos y en os-

curidad se agregó 3,3´,5,5´-tetrametilbenzidina (TMB) tividad de la CAT se realizó siguiendo la disminución de H₂O₂

Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) hasta observar color. La a través de la absorbancia a 240 nm en función del tiempo

cuantiﬁcación se realizó por espectrofotometría a 655 [38]. Para esta determinación, 30 μl del homogenizado de

Actividad de la catalasa (CAT): la determinación de la ac-

(

nm (Lector de placas -Bio-Rad, PowerPac, Basic).

pulmón o corazón se agregaron a 2,97 ml de buffer fosfa-

to (100 mM, pH= 7,2) y se midió la absorbancia basal de la

Metabolismo oxidativo

1. Generación de especies reactivas del oxigeno: El estudio M, y la absorbancia se registró cada 10 segundos durante 1

de las especies reactivas del oxígeno (ROS), principalmen- minuto. Esta reacción es de pseudo primer orden, por lo que

muestra a 240 nm. Después, se agregaron 5 μl de H O 8,8

2 2

te la producción intracelular del anión superóxido (O -), se graﬁca el ln (Abs240nm) en función del tiempo. La canti-

2

se realizó en el BAL de los animales de los 3 grupos expe- dad de catalasa de las distintas muestras se calculó a par-

rimentales mediante el ensayo del nitroazul de tetrazolio tir de la pendiente de esta curva, que representa el tiempo

(NBT) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), según el método de vida media de esta enzima. Los resultados se expresan

descripto por Hedley y Currie [35]. Las células obtenidas como pmol/mg de proteínas totales.

en el BAL se incubaron con una solución ﬁnal de NBT (0,05

%

-

en PBS) bajo agitación en un baño termostático (Dubnoff Parámetros Bioquímicos

Vicking, Argentina) durante 60 minutos a 37°C. Luego, el El análisis bioquímico a nivel sistémico se realizó en mues-

NBT se descartó y las células se ﬁjaron con p-formaldehido tras de sangre tomadas de animales de los tres grupos expe-

% (MP Biomedicals. Inc., Alemania) durante 10 minutos. rimentales. La sangre se recolectó por punción cardíaca y se

4

Las suspensiones celulares se centrifugaron a 800xg du- obtuvo el suero por centrifugación a 13800xg durante 10 minu-

rante 10 min, el sobrenadante se descartó y se agregaron tos. Se evaluaron en el perﬁl lipídico: colesterol total (Col Tot),

4

00 μl de polivinilpirrolidona (0,1 % en H O bidestilada) por lipoproteína de alta densidad (C-HDL) y triglicéridos (TG) y en

2

muestra. Para todos los grupos experimentales se realiza- el perﬁl enzimático: aspartato aminotransferasa (AST) y alani-

ron extendidos por duplicado y las células fueron cuanti- na aminotransferasa (ALT).

ﬁcadas por microscopía óptica (Nikon Alphaphot-2 V52, 1. Perﬁl lipídico: Los niveles séricos de Col Tot y TG se cuan-

Melville, Nueva York, USA). El resultado se informó como

el porcentaje de células reactivas, considerando células

reactivas aquellas que redujeron el NBT.

tiﬁcaron por métodos estandarizados (Roche Diagnostics,

Mannheim, Alemania) en un autoanalizador COBAS C501

(Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). La concentra-

ción de C-HDL se determinó mediante métodos de preci-

pitación selectivos que emplean ácido fosfotúngstico en

presencia de iones de magnesio [39].

2

. Determinación de antioxidantes: Superóxido Dismutasa

y Catalasa: Para las determinaciones de las enzimas an-

tioxidantes superóxido dismutasa y catalasa se pesaron y

disgregaron los pulmones y corazones de los animales de 2. Perﬁl enzimático: Las actividades enzimáticas de ALT y

los tres grupos experimentales mediante disrupción me-

cánica en PBS 1X (5 ml/gr tejido). Los homogeneizados se

centrifugaron 10 min a 800xg a 4ºC y los sobrenadantes

se guardaron a -20ºC hasta su evaluación.

AST fueron determinadas por métodos cinéticos en un au-

toanalizador Beckman (Beckman Coulter INC, Brea, USA).

Análisis Estadístico

Los resultados se expresaron como los valores medios ±

Actividad de la Superóxido Dismutasa (SOD): para la eva- la desviación estándar. Los experimentos se repitieron tres

luación de la actividad de la SOD, a 2,95 ml de buffer glicina veces para ambos grupos etarios y para todas las variables

50 mM, pH= 10,8) se le agregaron 50 μl de adrenalina (Sig- estudiadas. El tratamiento estadístico se realizó mediante

(

ma-Aldrich, St. Louis, USA) (60 mM pH = 2) y se registró la ANOVA (análisis de varianza) de dos factores y según co-

absorbancia a 480nm cada 10 segundos durante 1 minuto rresponda el post- test de Newman-Keuls o Bonferroni para

(Espectrofotómetro Shimadzu UV-1201V, Tokio, Japón). La revelar la existencia de diferencias signiﬁcativas (p < 0,05).

SOD es capaz de inhibir la oxidación de la adrenalina a ade-

nocromo, deﬁniéndose una unidad de actividad SOD como la Resultados

cantidad de enzima de una muestra capaz de causar el 50 % Caracterización ﬁsicoquímica de las partículas aéreas de la

de inhibición. Esta evaluación se determinó, también, luego Ciudad de Buenos Aires

del agregado de 10 y 30 μl de homogeneizado de pulmón o

El análisis morfoquímico de las partículas aéreas urba-

corazón, para luego comparar las cinéticas de la oxidación nas de Buenos Aires (UAP-BA) muestra partículas esféricas

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de tamaño heterogéneo con predominancia de partículas vascular, inﬁltrado inﬂamatorio en el epicardio e inﬂama-

pequeñas menores a 2,5 micrones (MP₂_,₅), presentando ción intersticial linfocitaria en el miocardio subepicárdico

un núcleo carbonoso con trazas de algunos metales identi- (Grado= 1) (Figura 2C). En ambos grupos de animales ex-

ﬁcándose principalmente los siguientes elementos: Al, Si, K, puestos a las partículas, tanto a las 24 como a las 48 horas

Mg, Fe, S, Cl, y Cu (Figura sup 1 y 2).

post-instilación, se observaron alteraciones en el epicardio

y el miocardio subepicárdico (Figura 2E-F y H-I). La respues-

ta en el tiempo dependió del tipo de MP, siendo esta tisular a

UAP-BA siempre más temprana que a ROFA.

Análisis Histomorfológico

Histología pulmonar

Con el ﬁn de evaluar posibles alteraciones en el tejido pul-

monar de ratones jóvenes o envejecidos expuestos a ROFA Histología Hepática

o UAP-BA en distintos tiempos, se realizaron análisis de cor-

La histología hepática correspondiente a ratones ex-

tes histológicos de pulmón. La instilación aguda de ambas puestos a ROFA o UAP-BA mostró claras diferencias en el

partículas ambientales aéreas provocó alteraciones en la parénquima y en las zonas vasculares en comparación con

histología pulmonar de ratones jóvenes mostrando una las correspondientes a ratones controles. La instilación in-

respuesta inﬂamatoria, caracterizada por una reducción tranasal de partículas ambientales aéreas provocó a nivel

en el espacio aéreo alveolar debido a la inﬁltración celular hepático inﬂamación intersticial compuesta principalmen-

compuesta principalmente de linfocitos y células polimorfo- te por inﬁltración de linfocitos (LIN) y polimorfonucleares

nucleares (Figura sup 3 A-I). En los animales envejecidos la (PMN), necrosis (N) y esteatosis (S) en todo el parénquima

respuesta inﬂamatoria se observó focalizada a las 3 horas afectando preferentemente la zona 3 (alrededor de la vena

post-instilación tanto para ROFA (Figura 1B) como UAP-BA central, VC).

(Figura 1C), mientras que a las 24 y 48 horas post-instila-

Los hígados de ratones jóvenes expuestos a ambos MP

ción se observó inﬁltración de tipo difusa (Figura 1E, H, F, I). presentaron esteatohepatitis mixta (grado 1) a las 3 ho-

ras post- instilación, aumentando marcadamente a las 24

Histología Cardíaca

horas post-instilación (Figura sup 4B1-B6). Los hígados de

A nivel cardíaco, la exposición a las partículas ambienta- ratones envejecidos controles (Figura 3A) mostraron leve

les aéreas indujo cambios histopatológicos sólo en el ven- inﬁltración inﬂamatoria (grado 0) característica del enve-

trículo derecho (VD) de los animales envejecidos (Figura jecimiento del hígado, así como en los expuestos a ambos

2). Los corazones de los animales controles presentaron un MP se observaron focos aislados de necrosis, inﬁltración

miocardio y epicardio normal (Grado = 0). Por el contrario, el inﬂamatoria moderada (LIN, PMN) y esteatohepatitis mix-

epicardio del VD de los ratones instilados con ROFA, a las 3 ta (grado 1) a las 3 horas post- instilación. Esta respuesta

horas post-instilación mostró la presencia focal de células leve fue aumentando en gravedad a través del tiempo, ob-

mesoteliales reactivas (Figura 2B), mientras que en el VD servándose a las 48 horas post-instilación una esteatosis

de los animales expuestos a UAP-BA se observó dilatación

Figura 2. Microfotografías del ventrículo derecho de ra-

tones envejecidos controles y expuestos a ROFA o UAP-

BA a través del tiempo. Coloración H&E. Ambos tipos de

partículas provocaron reacción inﬂamatoria del epicardio

del ventrículo derecho Mag. Ori. 100X.

Figura 1. Microfotografías del tracto respiratorio inferior de

ratones envejecidos controles y expuestos a ROFA o UAP-

BA a través del tiempo. Coloración H&E. Ori. Mag. 100X.

ꢀ

Nótese el aumento de inﬁltrado de células inﬂamatorias para ambas ꢀEl asterisco (*) muestra dilatación vascular e inﬁltrado inﬂamatorio.

partículas ambientales aéreas y para todos los tiempos ensayados.

6-I: El recuadro destaca la zona afectada con mayor aumento (200X).

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a nivel pulmonar y extrapulmonar en ratones jóvenes y adultos mayores

Figura 3. Microfotografías de hígados de ratones enve-

jecidos controles y expuestos a ROFA o UAP-BA a través

del tiempo.

Figura 4. Recuento Celular Total (RCT) y Diferencial (RCD)

en el BAL de ratones jóvenes expuestos a ROFA o UAP-BA a

través del tiempo.

ꢀ

La ﬁgura muestra la biocinética para RCT y RCD. A1 y A2): 3 horas, B1

y B2): 24 horas, C1 y C2): 48 horas post-instilación. MA: macrófagos

alveolares, PMN: polimorfonucleares, LIN: linfocitos. Los datos repre-

sentan el valor medio ± SD. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 respecto

del control. ### p<0,001 entre ROFA y UAP-BA

ꢀ

A: control. B expuestos a las partículas. Ambos tipos de partículas

provocaron una reacción inﬂamatoria. (II) Inﬂamación Intersticial,

Necrosis (N), Esteatosis (E), Vena Central (VC). Mag Orig. 400X

más intensa llegando a clasiﬁcarse como de grado 3 (Figura control para todos los tiempos ensayados (Figura 4 A2-C2

3B5-B6).

y 5 A2-C2).

Parámetros inﬂamatorios a nivel pulmonar

Recuento Celular Total y Diferencial en el BAL

Metabolismo Oxidativo

El metabolismo oxidativo es uno de los parámetros bio-

El número de células totales (RCT) y la composición celu- lógicos comúnmente empleados para evaluar la respuesta

lar diferencial (RCD) del lavado bronqueoalveolar (BAL) es local al MP. Su desbalance por aumento de especies oxi-

un indicador de la respuesta inﬂamatoria y del reclutamien- dantes, disminución de especies antioxidantes o ambos,

to de células al sitio de inﬂamación.

es indicativo de un posible daño a nivel celular. Se evaluó la

En animales jóvenes, ROFA presentó valores del RCT si- generación de especies oxidantes en el BAL y la actividad de

milares al grupo control para todos los tiempos ensayados enzimas antioxidantes a nivel pulmonar y cardíaco.

(

Figura 4A1-C1). En cambio, la exposición a UAP-BA estimu-

ló un aumento signiﬁcativo del RCT sólo a las 3 horas post- Generación de Anión Superóxido en el BAL

instilación (Figura 4A1). En animales envejecidos, sólo la

-

El análisis de la generación del anión superóxido (O )

2

exposición a ROFA, a las 3 horas post-instilación, estimuló el en el BAL de ratones BALB/c jóvenes mostró, a las 3 horas

aumento del RCT respecto de los animales controles (Figura post-instilación, un aumento signiﬁcativo sólo en las célu-

5

A1). A diferencia de ROFA, UAP-BA no provocó un aumento las provenientes de ratones expuestos a ROFA. En cambio, a

signiﬁcativo del RCT a través del tiempo (Figura 5A1-C1). las 24 y 48 horas post-instilación la exposición a ambos MP

Sin embargo, para las dos poblaciones etarias, ambas par- estimuló signiﬁcativamente la generación de esta especie

tículas ambientales aéreas provocaron una alteración en la reactiva del oxígeno (Figura 6A). En el BAL de los ratones

distribución sub-poblacional, con un aumento signiﬁcativo envejecidos, para ambos tipos de partículas ambientales

de células polimorfonucleares (PMN) respecto del grupo aéreas se observó una respuesta similar y dependiente

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Efecto de la inhalación de las partículas aéreas de la Ciudad de Buenos Aires: alteraciones histomorfológicas, metabólicas y bioquímicas

a nivel pulmonar y extrapulmonar en ratones jóvenes y adultos mayores

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Figura 5. Recuento Celular Total (RCT) y Diferencial (RCD)

en el BAL de ratones envejecidos expuestos a ROFA o UAP-

BA a través del tiempo.

Figura 6. Generación de Anión Superóxido en células del

lavado bronqueoalveolar de ratones jóvenes (A) o enve-

jecidos (B) expuestos a ROFA o UAP-BA a través del tiempo.

ꢀLa ﬁgura muestra la biocinética para RCT y RCD. A1 y A2): 3 horas,

B1 y B2): 24 horas, C1 y C2): 48 horas post-instilación. MA: Macró-

fagos alveolares, PMN: polimorfonucleares, LIN: linfocitos. Los datos ꢀLas barras representan el valor medio ± SD. * p<0,05, *** p<0,001

representan el valor medio ± SD. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001

respecto del control. # p<0.05 entre ROFA y UAP-BA.

respecto del control. El valor del control se representa como una línea

llena y el intervalo de dispersión como dos líneas punteadas

del tiempo. A las 3 horas post-instilación, no se registraron guno de los tiempos ensayados (Figura 7B). Tanto para ani-

cambios en la generación de O₂^-en el BAL de los animales males jóvenes (Figura 7C) como envejecidos (Figura 7D) la

expuestos a ROFA o UAP-BA. Sin embargo, a las 24 y 48 ho- actividad de la enzima CAT a nivel pulmonar se mantuvo sin

ras post-instilación ambos tipos de partículas estimularon cambios respecto del grupo control en el rango de tiempo

un aumento signiﬁcativo (p<0,001) en la generación de ensayado.

este radical libre (Figura 6B).

A nivel cardíaco, los animales jóvenes expuestos al MP

presentaron a las 24 horas post-instilación una disminu-

ción de la actividad de la SOD (Figura 8A) y CAT (Figura 8C).

Actividad de enzimas antioxidantes en pulmón y corazón

Con el ﬁn de determinar alteraciones en las defensas an- En animales envejecidos, la actividad de la SOD aumentó,

tioxidantes, se evaluaron a través del tiempo las enzimas signiﬁcativamente, sólo en los ratones expuestos a ROFA

superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) en homoge- a las 24 y 48 horas post-instilación. De manera similar a lo

neizados de pulmón y corazón de animales controles y ex- observado en el pulmón, a nivel cardíaco UAP-BA no provocó

puestos al MP.

variaciones en la actividad de SOD a través del tiempo (Fi-

Los pulmones de animales jóvenes expuestos a ROFA o gura 8B). La biocinética de la actividad de la enzima CAT en

UAP-BA no presentaron cambios en la actividad de la SOD los corazones de animales expuestos al MP se mantuvo sin

respecto al grupo control, en ninguno de los tiempos ensa- cambios respecto del grupo control en el rango de tiempo

yados (Figura 7A). En pulmones de animales envejecidos, la ensayado (8D).

exposición a ROFA, a las 24 horas post-instilación, provocó

un aumento signiﬁcativo de la actividad de la SOD. Tanto a Respuesta sistémica a la exposición al MP

las 3 como a las 48 horas post-instilación los valores fueron

Con el ﬁn de evaluar el efecto sistémico de ROFA y UAP-BA

similares a los basales. Los animales expuestos a UAP-BA se dosaron en el suero de ratones controles y expuestos a

no mostraron alteración en la actividad de la SOD para nin- las partículas ambientales aéreas, el perﬁl lipídico, enzimá-

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Efecto de la inhalación de las partículas aéreas de la Ciudad de Buenos Aires: alteraciones histomorfológicas, metabólicas y bioquímicas

a nivel pulmonar y extrapulmonar en ratones jóvenes y adultos mayores

Figura 7. Actividad en pulmón de la Superóxido Dismutasa y Catalasa de ratones jóvenes (A, C) o envejecidos (B, D) ex-

puestos a ROFA o UAP-BA a través del tiempo.

ꢀLas barras representan el valor medio ± SD. ** p<0,01 respecto del control. El valor del control se representa como una línea llena y el intervalo

de dispersión como dos líneas punteadas.

tico e inﬂamatorio como indicadores de daño a órganos e (Figura 9D). La enzima AST se encontró elevada sólo en el

inﬂamación.

suero de los animales expuestos a UAP-BA a las 3 y 48 horas

post-instilación (Figura 9D Y F).

Perﬁl lipídico

El análisis del perﬁl lipídico de los animales jóvenes (Ta- Perﬁl inﬂamatorio

bla Sup 1) y envejecidos (Tabla Sup 2) expuestos a ROFA o

Como parámetro de inﬂamación sistémico, se evaluó la

UAP-BA no mostró cambios en los valores de colesterol total citoquina pro-inﬂamatoria interleuquina 6 (IL-6) en suero

(Col Tot), lipoproteína de alta densidad (C-HDL) o triglicéri- de animales controles y expuestos a ROFA o UAP-BA. Los

dos (TG), respecto de los valores correspondientes al grupo animales jóvenes expuestos a cualquiera de las partículas

control en ninguno de los tiempos ensayados.

ambientales presentaron un aumento en los niveles de

IL-6 a las 3 horas post-instilación respecto de los controles,

disminuyendo y alcanzando niveles basales a las 24 horas

Perﬁl enzimático

Los indicadores sistémicos de posible daño en órganos (Figura 10A). En concordancia, en los animales envejecidos

como hígado y corazón, se evaluaron con un dosaje de los ambas partículas ambientales aumentaron signiﬁcativa-

niveles séricos de Alanina aminotransferasa (ALT) y Aspar- mente la liberación de esta citoquina a las 3 horas post-ins-

tato aminotransferasa (AST) de los animales controles y tilación. Sin embargo, el aumento provocado por ROFA en los

expuestos a ROFA o UAP-BA.

niveles de IL-6 alcanzó su máximo a las 3 horas, mantenién-

Los animales jóvenes expuestos a ambos MP mostraron dose signiﬁcativamente elevada a las 24 horas hasta caer a

niveles séricos elevados de la enzima AST sólo a las 3 horas niveles basales a las 48 horas. (Figura 10B).

post-instilación (Figura 9A). En cambio, la enzima ALT se

mantuvo elevada para todos los tiempos estudiados (Figu- Discusión

ra 9A-C). En los animales envejecidos, la exposición al MP

La acción de las partículas en la salud depende no sólo

provocó un aumento en el nivel enzimático sérico de ALT a de la composición química sino también de la concentra-

las 3 horas post-instilación, para ambos tipos de partículas ción, tiempo de exposición a las mismas y del grupo etario

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Efecto de la inhalación de las partículas aéreas de la Ciudad de Buenos Aires: alteraciones histomorfológicas, metabólicas y bioquímicas

a nivel pulmonar y extrapulmonar en ratones jóvenes y adultos mayores

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Figura 8. Actividad en corazón de la Superóxido Dismutasa y Catalasa de ratones jóvenes (A, C) o envejecidos (B, D) ex-

puestos a ROFA o UAP-BA a través del tiempo.

ꢀLas barras representan el valor medio ± SD. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 respecto del control. El valor del control se representa como una

línea llena y el intervalo de dispersión como dos líneas punteadas.

A nivel pulmonar, encontramos que en animales jóvenes ex- aparecieron siempre más tempranamente en los animales

puestos a las partículas aéreas de la Ciudad de Buenos Aires expuestos UAP-BA que en los animales expuestos a ROFA.

(UAP-BA), el recuento celular total (RCT) aumentó sólo tem- Esta respuesta podría ser consecuencia de diferencias en

pranamente (3 horas post-instilación). Sin embargo, el por- el tamaño aerodinámico y forma de estas dos partículas.

centaje de polimorfonucleares (PMN) aumentó para todos Dado que UAP-BA es más pequeña que ROFA, UAP-BA podría

los tiempos ensayados en las dos poblaciones etarias. En translocarse rápidamente al sistema vascular, ejerciendo

concordancia, la histología pulmonar mostró disminución su efecto más tempranamente en órganos a distancias.

del área alveolar debida a la inﬁltración de células inﬂama-

La respuesta inﬂamatoria en el sistema cardiorrespira-

torias. Por lo tanto, tal como sucede en otras megaciudades torio podría deberse a un desbalance oxidativo previo [49],

como Milano y Sao Paulo [40-42], en Buenos Aires las partí- por ello se abordó el análisis del metabolismo oxidativo en

culas urbanas causaron respuesta inﬂamatoria a nivel pul- pulmón y corazón de los animales jóvenes y envejecidos

monar en las dos poblaciones etarias estudiadas.

expuestos al MP. En este contexto, a nivel pulmonar se

Las partículas ambientales aéreas, principalmente las comprobó que ambas partículas, independientemente de

ultraﬁnas, pueden actuar a nivel local sobre el sistema res- su composición química incrementaron la generación de

-

piratorio como a distancia, llegando a órganos como hígado, anión superóxido (O ) en animales jóvenes y envejecidos.

2

corazón, bazo, cerebro [11,43-48]. Por ello, además de eva- Es conocido que los metales son inductores de la genera-

luar la respuesta local a nivel pulmonar, también se evaluó ción de radicales libres [50], por eso, se sugiere que son los

a nivel cardiaco y hepático la respuesta directa o indirecta metales presentes en ROFA [51,52] los que, a través de la

al MP. En este sentido, encontramos que UAP-BA y ROFA, producción de especies reactivas del oxígeno (ROS), indu-

desencadenaron una respuesta de tipo inﬂamatoria carac- cen la expresión de mediadores inﬂamatorios provocando

terizada por inﬁltración leucocitaria en corazón e hígado, injuria pulmonar [28,51,53] y cardíaca [54,55]. No obstan-

dilatación de los vasos en el epicardio cardíaco y zonas de te, MacNee y Donaldson [56] propusieron que los metales

necrosis a nivel hepático. Es importante señalar que a nivel presentes en el MP no son los únicos responsables de des-

cardíaco las señales indicativas de un proceso inﬂamatorio encadenar desbalance oxidativo. En este sentido. UAP-BA

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Efecto de la inhalación de las partículas aéreas de la Ciudad de Buenos Aires: alteraciones histomorfológicas, metabólicas y bioquímicas

a nivel pulmonar y extrapulmonar en ratones jóvenes y adultos mayores

Figura 9. Concentración sérica de ALT (U/L) y AST (U/L) a través del tiempo. Ratones jóvenes (A, B, C) o envejecidos (D, E,

F) controles (barras blancas), expuestos a ROFA (barras grises) o expuestos a UAP-BA (barras negras).

ꢀLas barras representan el valor medio ± SD. * p<0,05 ** p<0,01, *** p<0,001 respecto del control

se caracteriza por presentar alto contenido de compuestos biomarcadores séricos como la citoquina proinﬂamatoria in-

volátiles orgánicos y bajas trazas metálicas. Estos resulta- terleuquina IL-6 (IL-6), y las enzimas Alanino aminotransfe-

dos avalan la hipótesis de MacNee y Donaldson, la que sos- rasa (ALT) y Aspartato aminotransferasa (AST) en animales

tiene que para los animales expuestos a UAP-BA, la vía de jóvenes y envejecidos. Respecto de la IL-6, se encontró un

activación de señalización intracelular para la producción incremento en los niveles séricos de esta citoquina a las 3

de ROS podría deberse a la fracción orgánica. En cuanto a horas post-exposición en animales expuestos a ROFA o UAP-

la respuesta antioxidante, UAP-BA en ambas poblaciones BA de ambos grupos etarios. Este efecto está asociado a un

no movilizó las enzimas SOD y CAT, sugiriendo un posible aumento en la proporción de PMN y generación de ROS en

desbalance oxidativo a nivel pulmonar. Cabe destacar que, el BAL, indicativo de un proceso inﬂamatorio pulmonar. En

aunque en animales envejecidos ROFA movilizó la SOD (24 este sentido, Yu [58] demostró que la IL-6 juega un papel

horas post-instilación), histológicamente se observó daño crítico en la respuesta inﬂamatoria y el daño pulmonar en

a nivel pulmonar. A nivel cardíaco, para ambos MP, se encon- ratones luego de la exposición a contaminantes aéreos. En

tró una reducción en la actividad de la SOD y CAT (24 horas relación con las transaminasas, la enzima ALT es un conoci-

post-instilación) en animales jóvenes que mostraron alte- do marcador de hepatotoxicidad y la AST de hepatotoxicidad

ración del metabolismo oxidativo. Sin embargo, en anima- y/o enfermedades cardiovasculares [59]. Si bien ambas

les envejecidos la respuesta antioxidante fue dependiente enzimas responden al daño hepático, la concentración de

del MP. Sólo ROFA movilizó SOD para compensar un posible ALT en suero es el biomarcador más común y mejor esta-

aumento de especies activas del oxígeno evitando así el blecido para el diagnóstico y seguimiento de la enfermedad

desbalance oxidativo. En cuanto a UAP-BA, la ausencia de hepática aguda y crónica [60]. En animales jóvenes, la ex-

respuesta antioxidante sumada a la rápida respuesta inﬂa- posición a las partículas provocó aumento signiﬁcativo en

matoria a nivel cardíaco sugeriría que este MP, posiblemen- los niveles de ambas enzimas al menor tiempo estudiado (3

te debido a su menor tamaño aerodinámico, posee un grado horas post-instilación). Estos resultados concuerdan con

de toxicidad mayor que ROFA.

los publicados por Pan [61] donde reportan un aumento en

El desarrollo de enfermedades cardiovasculares y even- los niveles de ALT en individuos expuestos a MP₂_,₅, además

tos cardíacos agudos asociados al MP [5,6-57] podría in- sugieren que la exposición a largo plazo aumenta el riesgo

volucrar una respuesta sistémica [13]. Es por eso, que se de cáncer de hígado, siendo la base de la patogénesis la in-

estudió la respuesta sistémica a ROFA y UAP-BA mediante ﬂamación crónica. Por otro lado, los animales expuestos a

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Efecto de la inhalación de las partículas aéreas de la Ciudad de Buenos Aires: alteraciones histomorfológicas, metabólicas y bioquímicas

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menor tamaño aerodinámico de UAP-BA. En animales en-

vejecidos, sólo se encontró un aumento temprano (3 horas

post-instilación) en los niveles séricos de AST, coincidiendo

con las alteraciones hepáticas y cardiacas observadas his-

tológicamente.

En conclusión, los resultados obtenidos in vivo indican

que la exposición aguda a ROFA y UAP-BA, independiente-

mente del grupo etario, provocan una respuesta inﬂama-

toria y oxidativa a nivel pulmonar. Asimismo, la liberación

de mediadores inﬂamatorios y oxidativos pulmonares o las

partículas per se pueden llegar a la circulación e impactar a

nivel sistémico y en órganos a distancia.

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58

Efecto de la inhalación de las partículas aéreas de la Ciudad de Buenos Aires: alteraciones histomorfológicas, metabólicas y bioquímicas

a nivel pulmonar y extrapulmonar en ratones jóvenes y adultos mayores

Figuras Complementarias

Tabla 1 sup. Perﬁl lipídico sérico de ratones jóvenes con-

Tabla sup 2. Perﬁl lipídico sérico de ratones envejecidos

troles y expuestos a ROFA o UAP-BA a través del tiempo.

controles y expuestos a ROFA o UAP-BA a través del tiempo.

Perﬁl lipídico (mg/dl)

Col Tot

C-HDL

TG

Col Tot

C-HDL

TG

Control

ROFA₃_h

139,0±32,8

123,7±24,1

127,0±12,3

138,3±4,2

153,3±16,1

106,0±22,8

106,4±12,1

87,8±15,7

88,8±13,8

94,0±1,5

95,7±10,2

104,7±2,5

78,0±5,8

88,0±11,3

214,6±46,9

126,6±31,3

122,0±1,0

152,7±44,3

183,7±75,9

148,8± 20,9

199,2±32,2

Control

ROFA₃_h

100,4±19,6

112,0±24,2

104,0±16,2

117,8±17,8

97,2±12,9

85,0±10,3

109,5±3,5

82,8±16,9

97,5±21,4

92,0±11,5

91,5±18,5

72,7±6,6

76,0±0,1

83,0±2,3

198,2±56,9

193,0±9,2

150,5±28,3

155,0±44,9

196,5±70,1

113,0± 8,8

93,5±30,4

UAP-BA₃_h

ROFA₂₄_h

UAP-BA₃_h

ROFA₂₄_h

UAP-BA₂₄_h

ROFA₄₈_h

UAP-BA₂₄_h

ROFA₄₈_h

UAP-BA₄₈_h

ꢀLos valores representan las medias ± SD.

Figura 1 sup. Análisis morfológico de UAP-BA. Microscopía

Figura 2 sup. Análisis de energía dispersiva de rayos X

electrónica de Barrido (MEB) de UsuAP-BA.

(EDS) de las partículas aéreas de Buenos Aires (UAP-BA).

Figura 4 sup. Microfotografías de hígados de ratones

jóvenes controles y expuestos a ROFA o UAP-BA a través del

tiempo.

ꢀA). Mag. Orig. 2500X. B) Mag. Orig. 5000X. y C) Mag. Orig 80000X.

Figura 3 sup. Microfotografías del tracto respiratorio inferior

de ratones jóvenes controles y expuestos a ROFA o UAP-BA

a través del tiempo.

ꢀ

Coloración H&E. Ori. Mag. 100X. Nótese el aumento de inﬁltrado de célu-

las inﬂamatorias para ambas partículas ambientales aéreas en todos ꢀA: control. B expuestos a las partículas. Ambos tipos de partículas

los tiempos ensayados.

provocaron esteatosis (E). Vena Central (VC). Mag Orig. 400X

ByPC 2018;82(1):45-58.