Detección molecular de Trypanosoma cruzi. Experiencia en un hospital público  
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ARTÍCULO ORIGINAL  
Detección molecular de Trypanosoma cruzi.  
Experiencia en un hospital público  
Irurtia, María Cecilia; Magdaleno, María Alejandra; Peluffo, Graciela; Di Bartolomeo, Susana; Montenegro, Graciela  
1Laboratorio de Microbiología, Servicio de Bioquímica, Departamento de Diagnóstico y Tratamiento, Hospital Nacional “Pro-  
fesor Alejandro Posadas”, Morón, Provincia de Buenos Aires, Argentina.  
Contacto: Irurtia, María Cecilia. Laboratorio de Microbiología, Servicio de Bioquímica, Departamento de Diagnóstico y Tra-  
tamiento, Hospital Nacional “Profesor Alejandro Posadas”. Presidente Ilia y Marconi s/Nro., El Palomar, Morón, Provincia de  
Buenos Aires, Argentina; bioqceciliairurtia@gmail.com  
Resumen  
Introducción: el diagnóstico de Chagas agudo, congénito y de reactivación chagásica se basa en la ob-  
servación microscópica del parásito. Debido a la baja sensibilidad de estas técnicas se han desarrollado mé-  
todos de biología molecular para su diagnóstico. Objetivo: evaluar la utilidad de la reacción en cadena de la  
polimerasa (PCR) para la detección del Trypanosoma cruzi. Materiales y métodos: se determinó el límite de  
detección (LoD) a partir de una curva de parásitos y la sensibilidad analítica con diluciones seriadas de ADN  
de T. cruzi usando 2 PCR in-house. Se estudiaron 53 muestras de recién nacidos de madres seropositivas para  
Chagas y 25 de pacientes crónicos con sospecha de reactivación chagásica. Las técnicas utilizadas fueron:  
micrométodo para sangre, observación microscópica directa para LCR y dos PCR (PCR-ADN kinetoplastídico  
y PCR-ADN nuclear). Resultados: el LoD para ADN nuclear fue 1,45 parásitos/ml (IC 95 %: 1,06 - 3,54) y para  
ADN del kinetoplasto fue 1,00 parásitos/ml (IC 95 %: 0,76 - 1,77). La sensibilidad analítica en ambas PCR fue  
de 0,1 fg/μl. En el total de muestras (n = 78), la cantidad de positivos detectados por PCR fueron significativa-  
mente mayores que con los métodos directos (33 % vs. 9 %, p < 0,01). El índice de concordancia Kappa entre  
ambos métodos fue “aceptable” (Kappa = 0,698; p < 0,0001) para recién nacidos y “malo” (Kappa = 0,083; p  
=
0,299) para pacientes crónicos con sospecha de reactivación chagásica. Conclusiones: la sensibilidad de  
la PCR superó ampliamente a la de los métodos parasitológicos directos. La implementación de las técnicas  
de biología molecular para detección de T. cruzi aumentaría el número de pacientes beneficiados por un tra-  
tamiento precoz.  
Palabras clave: Trypanosoma cruzi, enfermedad de Chagas, diagnóstico molecular, PCR, ADN satélite, ki-  
netoplasto.  
Introduction: the diagnosis of acute and congenital Chagas disease, as well as of Chagas disease reacti-  
vation, is based on the microscopic observation of the parasite. Due to the low sensitivity of this technique,  
molecular methods have been developed for this diagnosis. Objective: To evaluate the usefulness of the po-  
lymerase chain reaction (PCR) for the detection of Trypanosoma cruzi. Materials and methods: The limit of  
detection (LoD) was determined with a curve of parasites and the analytical sensitivity with serial dilutions of  
Trypanosoma cruzi DNA, by using two in-house PCRs. We studied 53 samples from newborns born to mothers  
who were seropositive for Chagas and 25 from chronic patients with suspected Chagas disease reactivation.  
The techniques used were: micro-method for blood, direct microscopic observation for CSF and two PCR (ki-  
netoplastic DNA-PCR and nuclear DNA-PCR). Results: The LoD for nuclear DNA was 1.45 parasites/ml (CI 95 %:  
Abstract  
1.06 - 3.54), whereas that for kinetoplast DNA was 1.00 parasites/ml (CI 95 %: 0.76 - 1.77). The analytical sen-  
sitivity in both PCRs was 0.1 fg/μl. In the samples studied (n = 78), the number of positive samples detected  
by PCR was significantly higher than detected with the direct methods (33 % vs. 9 %, p < 0.01). The Kappa con-  
cordance index between both methods was “acceptable” (Kappa = 0.698; p < 0.0001) for newborns and “bad”  
(
Kappa = 0.083; p = 0.299) for chronic patients with suspected Chagas disease reactivation. Conclusions: The  
ISSN 1515-6761 Ed. Impresa  
ISSN 2250-5903 Ed. CD-ROM  
Código Bibliográfico: RByPC  
Fecha de recepción:  
sensitivity of PCR exceeded that of direct parasitological methods. The implementation of molecular biology  
techniques for the detection of T. cruzi would increase the number of patients diagnosed, who will in turn be  
benefited by an early treatment.  
1
2/09/17  
Fecha de aceptación:  
0/10/17  
Key words: Trypanosoma cruzi, Chagas disease, molecular diagnosis, PCR, satellite DNA, kinetoplast.  
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ByPC 2018;82(1):28-34.  
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Detección molecular de Trypanosoma cruzi. Experiencia en un hospital público  
Introducción  
complejidad. Debido a la baja sensibilidad de estas técnicas y  
La Enfermedad de Chagas es causada por el parásito Trypa- con el advenimiento de la Biología Molecular se han desarro-  
nosoma cruzi, el cual es transmitido al hospedador vertebrado llado, en los últimos años, una gran cantidad de técnicas mo-  
a través de un vector (triatomino) infectado. Existen otras vías leculares para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas [9].  
de transmisión no vectoriales como la transplacentaria, trans- Entre estos, se encuentran la PCR para la detección de la región  
fusión de sangre, trasplante de órganos, ingesta de alimentos variable del ADN de minicírculo del kinetoplasto de T. cruzi y la  
contaminados con parásitos y accidentes de laboratorio.  
PCR para la detección de una secuencia de 195 pares de bases  
La infección por T. cruzi constituye un problema de salud del ADN satélite de T. cruzi. Estas PCR tienen gran sensibilidad  
de relevancia social y económica en muchos países de Améri- ya que se basan en la amplificación de secuencias repetitivas. A  
ca Latina. Ha sido reconocida por la Organización Mundial de la su vez, revisten de una elevada especificidad debido a que sólo  
Salud (OMS) como una de las 13 enfermedades tropicales des- amplifican el ADN de T. cruzi y no de otros parásitos relacionados  
atendidas del mundo [1,2]. La OMS ha estimado, para Latinoa- [10,11]. Como ambas secuencias se encuentran representa-  
mérica, que cerca de 8 millones de personas permanecen hoy das en un número de copias muy similar, las diferencias en el lí-  
infectadas por T. cruzi. En nuestro país, habría entre 1.500.000 mite de detección de cada técnica dependen de la optimización  
y 2.000.000 de niños y adultos infectados [3], por lo que se de cada reacción.  
considera la principal endemia. Según datos del Ministerio de  
En muchos trabajos se han realizado comparaciones entre  
Salud de la Nación (Programa Nacional de Chagas) la seropre- la PCR y los métodos parasitológicos directos para la detección  
valencia de infección por T. cruzi en embarazadas en Argentina de T. cruzi reportándose en todos ellos un incremento de casos  
fue de 6,8 % en 2000 y 4,84 % en 2010. En base a estos datos, positivos por PCR [12-16].  
se estima que cada año nacen 1300 niños infectados por trans-  
misión congénita.  
Considerando que el tratamiento temprano presenta gran-  
des beneficios, existe la necesidad de contar con un ensayo  
En nuestro país, la situación actual de control de Chagas es sensible, específico y rápido para el diagnóstico de los casos  
heterogénea y en las regiones no endémicas existe riesgo de de Chagas agudo, congénito y de reactivación chagásica. Los  
transmisión congénita derivado de las migraciones, lo que tam- métodos parasitológicos, aunque precoces y altamente especí-  
bién ocurre en otras partes del mundo [4].  
ficos son poco sensibles mientras que los métodos serológicos  
Durante el curso de la Enfermedad de Chagas se puede distin- dan un diagnóstico tardío. Por tal motivo, cobran relevancia las  
guir una fase aguda, caracterizada por una abundante parasite- características de las técnicas de biología molecular al combi-  
mia, seguida de una fase indeterminada de recuperación, hasta nar alta sensibilidad y especificidad.  
finalmente instaurarse la fase crónica de la enfermedad. Ésta  
El objetivo del presente trabajo fue evaluar la utilidad de la  
última se caracteriza por la presencia de anticuerpos IgG espe- detección molecular de Trypanosoma cruzi realizando dos re-  
cíficos y de una parasitemia escasa e intermitente con un curso acciones en cadena de la polimerasa (PCR), con diferentes ce-  
clínico impredecible, que va desde la ausencia de síntomas has- badores y comparar su capacidad de detección respecto a los  
ta una enfermedad severa con compromiso cardiovascular y/o métodos parasitológicos directos en pacientes crónicos y en  
gastrointestinal que pueden ocasionar la muerte [5,6]. Los pa- recién nacidos de madre chagásica atendidos en este hospital.  
cientes con Chagas crónico que sufren algún grado de inmuno-  
supresión (trasplante de órganos, infección por VIH, tratamiento Materiales y métodos  
oncológico) pueden presentar una reactivación del T. cruzi.  
La demostración de la presencia del parásito constituye el  
diagnóstico de certeza para definir la reactivación de la enfer-  
medad o para el diagnóstico de la infección en los recién nacidos  
1. Aislado parasitario/curva de parásitos. Se utilizaron epimasti-  
gotes de cultivo de T. cruzi linaje CLBr, provistos por el Labora-  
torio de Biologia Molecular de La Enfermedad de Chagas-IN-  
GEBI, a partir de los cuales se realizaron diluciones seriadas  
en sangre seronegativa. Para estas se partió de una concen-  
tración de 1000 parásitos/ml hecha por recuento en cámara  
de Neubauer y se realizaron las diluciones de 100, 20, 10, 5,  
1 y 0,5 par/ml. De cada dilución se realizaron 9 extracciones  
del ADN (ver ítem 5) que fueron procesadas acorde a lo des-  
cripto más adelante.  
[7]. En etapas posteriores, el diagnóstico de laboratorio se basa  
en la detección de anticuerpos específicos [8].  
El Ministerio de Salud de la Nación a través del Programa  
Nacional de Chagas recomienda que el niño recién nacido, hijo  
de madre infectada sea estudiado en las primeras semanas de  
vida por métodos parasitológicos directos y a partir de los 10  
meses de edad por métodos serológicos [7]. Cabe consignar 2. Curvas de sensibilidad de ADN: partiendo de una alícuota de  
que 9 de cada 10 niños tratados en fase aguda y 8 de cada 10  
niños tratados en la fase crónica negativizan los anticuerpos, lo  
cual forma parte de los criterios de “curación” [7]. Por tal moti-  
vo, la detección temprana del parásito resulta fundamental a la  
hora de prevenir complicaciones posteriores.  
ADN puro de parásitos, se midió la concentración del mismo  
a 280 nm en un espectrofotómetro Nanodrop (EEUU) y luego  
se realizaron diluciones seriadas en sangre entera anticoa-  
gulada con EDTA con serología negativa para Chagas, hasta  
obtener las siguientes concentraciones: 1000 fg/μl, 100 fg/  
μl, 10 fg/μl, 1 fg/μl y 0,1 fg/μl. Cada dilución se extrajo según  
ítem 5 y se realizaron corridas por duplicado.  
Los métodos parasitológicos directos se basan en la ob-  
servación por microscopía del parásito y son los comúnmente  
utilizados ya que pueden ser realizados en laboratorios de baja 3. Muestras de Pacientes. Se analizaron 78 muestras con soli-  
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citud médica de parasitemia para Chagas atendidos en este  
hospital: 53 muestras de sangre de 44 recién nacidos de ma-  
dres seropositivas para Chagas (RN) y 25 muestras de 11  
pacientes chagásicos crónicos. Entre los pacientes crónicos  
se incluyeron 2 muestras de sangre de pacientes pediátricos  
La PCR se llevó a cabo mediante el siguiente programa: un ciclo  
inicial a 94 ºC durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos de 60  
segundos a 94 ºC, 30 segundos a 58 ºC y 60 segundos a 72 ºC.  
Todas las técnicas de amplificación se realizaron con el ter-  
mociclador DNAEngine de BioRad (CA, EEUU).  
inmunosuprimidos (uno con Linfoma + HIV y el otro con leuce- 8. Procedimiento y controles internos. Cada muestra se proce-  
mia linfocítica aguda) y 17 muestras de sangre y 6 muestras  
só por duplicado con controles negativos entre cada una,  
un control de reactivos y tres controles positivos de distinta  
concentración en cada ensayo. Simultáneamente, se realizó  
un control de idoneidad de la muestra mediante una amplifi-  
cación del gen β-actina humana.  
. Métodos parasitológicos. Se realizó la observación directa al 9. Electroforesis de ADN en geles de agarosa. La electroforesis  
de LCR de 9 pacientes HIV (+) con lesión ocupante de espacio  
(LOE), compatible con “Chagoma” cerebral. Las muestras per-  
tenecientes a un mismo paciente corresponden a distintos  
momentos durante el curso del seguimiento médico.  
4
microscopio óptico para los LCR y el micrométodo para san-  
gre [17]. El micrométodo fue adaptado acorde a las siguien-  
tes modificaciones: se colocó 1 ml de sangre entera en un  
tubo estéril y se dejó decantar 24 horas a temperatura am-  
biente, luego se tomaron 12 gotas de la interfase (zona de  
glóbulos blancos) y se colocaron entre porta y cubreobjetos.  
La observación microscópica se realizó en 10X y 40X por mi-  
croscopía con contraste de fase, recorriendo la totalidad de  
los campos en los 12 preparados.  
se realizó en geles de agarosa (Invitrogen, CA, EEUU) al 2 %  
utilizando Buffer TAE (Tampón Tris Acetato 40 mM, EDTA 0,5  
M pH 8,0) y un sistema de electroforesis horizontal (Bio Rad,  
Sub Cell GT, CA, EEUU). Se empleó un voltaje de 90V durante  
45 min. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio (Bio Ba-  
sic Inc, Ontario, Canadá). Las bandas de ADN se visualizaron  
con transiluminador de luz ultravioleta (UV Transilluminator  
UVP). El tamaño de las bandas de ADN se estimó comparán-  
dolas con un marcador de peso molecular de 100 pb (Invitro-  
gen, CA, EEUU).  
5
. Extracción de ADN. Se realizó la extracción de ADN de todas  
las muestras y de las diluciones de parásitos utilizando co- 10. Análisis estadístico. El LoD se calculó como la carga parasita-  
lumnas comerciales (Roche, Mannheim, Alemania), según  
indicaciones del fabricante y reservando a -20 ºC hasta su  
procesamiento. Se incluyó en cada tanda de extracción un  
control usando sangre seronegativa.  
. Técnica de PCR para la detección de ADN de minicírculo de ki-  
netoplasto de T. cruzi (k-DNA). Se realizó una adaptación del  
protocolo descrito por Burgos y col. [18], mediante la cual se  
amplifica una banda de 330 pares de bases (pb) empleando  
los cebadores 121 5’-AAATAATGTACGGGKGAGATGCATGA-3’, y  
ria más baja que proporciona ≥ 95 % de los resultados detec-  
tables por PCR para ambos blancos moleculares, de acuerdo  
con las normas del Instituto de Estándares Clínicos y de La-  
boratorio [20] adaptadas a los propósitos de este trabajo. El  
LoD se calculó por análisis de regresión Probit con Minitab  
15 Statistical Software (Minitab Inc., 2014, State College, PA,  
EEUU).  
Para la comparación de proporciones se aplicó el test de Fis-  
her y para evaluar la concordancia se calculó el índice Kappa,  
confeccionando las tablas de contingencia. Se aplicó la esca-  
la propuesta por Landis y Koch [21] para la interpretación  
del índice Kappa. Para el análisis estadístico se utilizó el soft-  
ware SPSS 19.0 (IBM, Ill, EEUU).  
6
122 5’-GGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATA-3’. Brevemente, las  
condiciones de reacción fueron: Buffer 1X, desoxinucleóti-  
dostri-fosfato (dNTP) 0,25 mM, cebadores 2,5 μM, cloruro de  
magnesio 3 mM y Polimerasa 0,75 U (taqPlatinum de Invitro-  
gen con sistema Hot start. CA, EEUU) para un volumen final  
de mezcla de reacción de 25 μl y volumen de muestra de 5 Resultados  
μl. La PCR se llevó a cabo mediante el siguiente programa: un Cálculo de sensibilidad analítica:  
ciclo inicial a 94 ºC durante 3 minutos, seguido de 5 ciclos de  
El LoD mediante análisis Probit fue 1,45 parásitos/ml (IC 95 %  
4
7
5 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 68 ºC y 45 segundos a 1,06 - 3,54) para PCR sat-DNA y 1,00 parásitos/ml (IC 95 % 0,76  
2 ºC, luego 35 ciclos de 45 segundos a 94 ºC, 45 segundos - 1,77) para k-DNA (Tabla I).  
a 64 ºC y 45 segundos a 72 ºC, finalmente a 72 ºC durante 10  
minutos.  
Las figuras 1 y 2 corresponden a las corridas electroforéticas  
mostrando los resultados de las amplificaciones. Se observa  
7
.TécnicadePCRparaladeteccióndeADNsatélitedeT.cruzi(sat- una banda predominante a la altura de 330 pb para las corridas  
DNA). Se emplearon los cebadores específicos diseñados realizadas con los cebadores de k-DNA y una banda predomi-  
por Piron y col. [19]: TC1 5’-ASTCGGCTGATCGTTTTCGA-3’ y TC2 nante a la altura de 188 pb correspondientes a una unidad de  
5’-AATTCCTCCAAGCAGCGGATA-3’. Estos cebadores permiten la repetición del ADN satélite. Las bandas de peso molecular supe-  
amplificación de una región repetida de 166 pares de bases rior son multímeros de la unidad de ADN satélite.  
delADNsatélitedeT. cruzi. Durantelapuestaapuntodelatéc-  
La sensibilidad analítica expresada en masa de ADN para los  
nica se optimizaron las condiciones de reacción, las cuales 2 sistemas de amplificación estudiados fue 0,1 fg/μl. Si se con-  
fueron: Buffer 1X, dNTP 0,25mM, cebadores 0,5 μM, cloruro sidera que un parásito contiene aproximadamente 200 fg de  
de magnesio 3 mM y Polimerasa 0.6 U (taqPlatinum de Invi- ADN, la sensibilidad analítica determinada en masa de ADN sería  
trogen con sistema Hot start. CA, EEUU) para un volumen final equivalente a aproximadamente 0,5 par/ml, lo cual es levemen-  
de mezcla de reacción de 25 μl y volumen de muestra de 5 μl. te inferior a los resultados obtenidos en la curva de parásitos.  
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Detección molecular de Trypanosoma cruzi. Experiencia en un hospital público  
Figura 1. Productos de amplificación de la PCR para la curva  
de parásitos de T. cruzi (parásitos/ml).  
Figura 2. Productos de amplificación de la PCR para la curva  
de masa de ADN de T. cruzi (fg/μl).  
ꢀ
a) con cebadores 121-122 para k-DNA se observa banda a la altura de 330 pb  
b) con cebadores TC1 y TC2 para sat-DNA se observa banda a la altura de 188 pb  
PM: Marcador de peso molecular de 100 pb  
Comparación de los métodos en muestras de pacientes:  
lizadas, 7 presentaron PCR positiva y 4 micrométodo positivo  
Entre las 78 muestras analizadas, 26 presentaron PCR po- (Tabla III). En 9 de los 44 RN se documentaron resultados de 2  
sitiva y 7 fueron micrométodo positivo. Es destacable que nin- muestras en diferentes períodos. Entre ellos se destacó un caso  
guna de las muestras con micrométodo positivo fue negativa en el que el resultado de la PCR fue positivo al nacer y a los 18  
por PCR (Tabla II). El índice Kappa calculado en el total de las días de vida, mientras que el micrométodo fue positivo solamen-  
muestras fue de 0,329 (p < 0,0001), constatando la “regular” te en la segunda muestra. La concordancia entre los métodos  
concordancia, en general, entre los métodos.  
en este subgrupo de muestras puede considerarse “aceptable”  
En el grupo de los RN entre las 53 muestras de sangre ana- ya que el índice Kappa fue de 0,698 (p < 0,0001).  
Entre las 25 muestras de pacientes crónicos analizadas, 19  
presentaron PCR positiva y sólo 3 fueron positivas por micróme-  
Tabla I. Curva de parásitos/ml para las dianas sat-DNA  
todo. Nuevamente, ninguna de las muestras con micrométodo  
y k-DNA.  
Tabla II. Resultados de PCR y MM en el total de muestras  
analizadas (n = 78).  
ꢀ
Pos: Número de ensayos que detectaron ADN de T. cruzi; Neg: Núme- ꢀPCR, reacción en cadena de la polimerasa; MM, micrométodo. Se  
ro de ensayos que no detectaron ADN de T. cruzi.  
El análisis Probit arrojó un LoD de 1,45 parásitos/ml (IC 95 % 1,06 -  
consideró PCR (+) a aquellas muestras que fueron positivas en las  
dos reacciones evaluadas.  
3
,54) para PCR sat-DNA y de 1,00 par/ml (IC 95 % 0,76 - 1,77) para  
Kappa= 0,329 (IC 95 % 0,135 - 0,524); p < 0,0001.  
Grado de acuerdo “regular”.  
PCR k-DNA.  
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Detección molecular de Trypanosoma cruzi. Experiencia en un hospital público  
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Tabla III. Resultados de PCR y MM en muestras de recién  
Tabla IV. Resultados de PCR y MM en muestras de pacien-  
nacidos (n = 53).  
tes crónicos (n = 25).  
ꢀ
PCR, reacción en cadena de la polimerasa; MM, micrométodo. Se  
consideró PCR (+) a aquellas muestras que fueron positivas en las  
dos reacciones evaluadas.  
ꢀPCR, reacción en cadena de la polimerasa; MM, micrométodo. Se  
consideró PCR (+) a aquellas muestras que fueron positivas en las  
dos reacciones evaluadas.  
Kappa= 0,698 (CI95 % 0,382 - 1,000); p < 0,0001.  
Grado de acuerdo “aceptable”.  
Kappa= 0,083 (CI95 % 0,025 - 0,190); p= 0,299.  
Grado de acuerdo “malo”.  
positivo presentó PCR negativo (Tabla IV). La concordancia en- con compromiso del sistema inmune y serología positiva para  
tre los métodos en las muestras de este subgrupo de pacientes Chagas, presentaron ambos PCR positiva y micrométodo nega-  
fue “mala” (Kappa = 0,083; p = 0,299).  
tivo (Tabla V).  
La Tabla V describe en detalle los resultados de los pacientes  
La figura 3 compara el porcentaje de positividad por la PCR  
con sospecha de reactivación chagásica. Al analizar los resulta- y el micrómetodo diferenciando entre pacientes recién nacidos  
dos de los 9 pacientes HIV (+) con LOE, 6 resultaron positivos y crónicos. Como se puede observar el número de positivos es  
para T. cruzi (3 sólo por PCR y los otros 3 por ambas técnicas). significativamente mayor al utilizar la PCR que al utilizar el mi-  
Asimismo, en coherencia con una mayor sensibilidad de las crométodo.  
técnicas de biología molecular, durante los controles postrata-  
miento el micrométodo negativizó antes que la PCR. De los 6 LCR Discusión  
estudiados 4 fueron positivos por PCR, de los cuales sólo 1 de  
El resultado más relevante del trabajo fue poder documentar  
ellos presentó microscopía positiva. Los pacientes pediátricos la mayor capacidad de detección de la PCR con respecto a los  
métodos tradicionales usando muestras de sangre y LCR. Esta  
mayor sensibilidad se observó tanto en muestras de pacientes  
Tabla V. Detalle de resultados de PCR y MM de pacientes  
crónicos, así como en muestras de recién nacidos de madre  
crónicos con sospecha de reactivación chagásica (n=11).  
chagásica.  
El diagnóstico serológico de la infección neonatal por T. cruzi  
se ve impedido debido a la transferencia pasiva de los anticuer-  
pos IgG de la madre. Por otro lado, si bien en la infección congéni-  
ta suele haber parasitemia, ésta no es siempre detectada por los  
métodos parasitológicos tradicionales (tal como fue observado  
en el presente estudio). La PCR, que detecta y amplifica peque-  
ñas cantidades de ADN parasitario, provee una alternativa com-  
plementaria para el diagnóstico de esta infección en el neonato  
y establecer el tratamiento lo más precozmente posible.  
En el Hospital Posadas se aconseja tomar dos muestras de  
sangre en los bebés: una al nacimiento y la otra a las 2 - 4 sema-  
nas de vida. De esta manera, se amplía el rango de detección del  
parásito. En el caso que las dos muestras sean negativas, los  
bebés deberán estudiarse a los 10 meses de vida por métodos  
serológicos. En este medio, resulta de suma utilidad el hecho de  
contar con esta herramienta diagnóstica de alta sensibilidad  
debido a que la mayoría de los bebés de madre chagásica no  
vuelven al Hospital para una segunda toma de muestra ni para  
el control serológico de los 10 meses. Al poder brindar un resul-  
tado positivo aún con la primera muestra, más niños podrían ser  
ꢀ
NEG, negativo; POS, positivo; tto, inicio del tratamiento; LOE, lesión  
ocupante de espacio, PCR, reacción en cadena de la polimerasa;  
MM, micrométodo. *Para LCR se realiza microscopía directa. Se  
consideró PCR (+) a aquellas muestras que fueron positivas en las  
dos reacciones evaluadas.  
beneficiados con el tratamiento antiparasitario.  
Si bien el tratamiento temprano de la enfermedad de Chagas  
congénito presenta una buena repuesta terapéutica, con índi-  
ces de curación cercanos al 100 %, en la actualidad se descono-  
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Detección molecular de Trypanosoma cruzi. Experiencia en un hospital público  
La concordancia obtenida en el grupo de los recién nacidos fue  
aceptable”, mientras que en el grupo de los pacientes crónicos  
Figura 3. Resultados de las muestras por biología molecu-  
lar y métodos directos acorde al tipo de paciente.  
“
fue “mala”. Esto se debe a que en general las parasitemias suelen  
ser más bajas en la etapa crónica de la enfermedad, y por lo tanto  
más difícilmente detectables por observación microscópica.  
Una de las limitaciones de este trabajo es que no se contó con  
la serología a los 10 meses de los bebés, consecuentemente la  
tasa de falsos positivos de PCR no pudo ser determinada. No  
obstante, para realizar este trabajo se minimizaron los riesgos  
de contaminación (principal fuente de falsos positivos en este  
tipo de técnicas) utilizando las áreas separadas del laboratorio  
de biología molecular, los controles de reactivos y el control ne-  
gativo de extracción en cada ensayo. Asimismo, se considera-  
ron como positivas sólo aquellas muestras que fueron positivas  
por ambas técnicas de PCR. De este modo, es asumido que la  
tasa de falsos positivos fue nula o al menos mínima.  
En conclusión, estos resultados muestran una mayor sen-  
sibilidad de la PCR respecto a los métodos tradicionales y son  
similares a los de publicaciones previas [16-24-27]. Por tal mo-  
tivo, el presente trabajo permite aconsejar el uso de la PCR en el  
diagnóstico de la infección congénita y reactivación chagásica.  
Agradecimientos: Al Dr. Darío Siciliani, médico del Servicio  
de Epidemiología del Hospital Prof. A. Posadas, por sus aportes  
y a la Dra. Silvia Balconi, jefa del servicio de Bioquímica, por su  
apoyo. Un agradecimiento especial al Dr. Tomás Meroño por su  
asesoramiento para la publicación de este trabajo.  
ꢀ
NEG, negativo; POS, positivo; PCR, reacción en cadena de la polimera-  
sa; MM, micrométodo  
Conflictos de interés: Los autores declaran no tener ningún  
conflicto de intereses.  
*p= 0.0002  
Referencias bibliográficas  
ce la eficacia del tratamiento durante la fase crónica de la infec- 1. Mathers CD, Ezzati M, Lopez AD. Measuring the Burden  
ción. Hasta el momento, el consenso sobre el criterio de “cura”  
comprende la negativización de las pruebas serológicas [22].  
Sin embargo, la negativización de los títulos de anticuerpos en  
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Disease Framework. Brooker S, ed. PLoS Neglected Tropical  
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los pacientes crónicos no ocurre antes de 8 o 10 años después 2. Hotez PJ, Molyneux DH, Fenwick A, Kumaresan J, Sachs SE,  
del tratamiento y en una proporción de pacientes no superior  
al 15 %. Por lo tanto, es necesario el uso de nuevos marcadores  
Sachs JD, et al. Control of neglected tropical diseases. New  
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que permitan determinar la disminución de la carga parasitaria 3. JanninJ,SalvatellaR.Estimacióncuantitativadelaenferme-  
o la eliminación completa del parásito después del tratamiento.  
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En los últimos años, la detección de ADN mediante la PCR y la  
de la Salud 2006; OPS/HDM/CD/425-06, 28 pp.  
PCR en tiempo real se ha convertido en las mejores alternativas 4. Fumadó V, Juncosa T,Posada E, Fisa R, Gállego M, Gascón  
[23].  
J. Chagas pediátrico en zona no endémica. Enferm Infecc  
Los límites de detección determinados en ambas PCR están  
Microbiol Clin 2014;32(5):293–296.  
dentro de los parámetros considerados adecuados para el diag- 5. Prata A. Clinical and epidemiological aspects of Chagas di-  
nóstico de infección por T. cruzi, según los criterios propuestos  
sease. Lancet Infect Dis 2001;1(2):92-100.  
en un estudio internacional de PCR para Chagas, aplicado a ca- 6. Rassi A Jr, Rassi A, Marin-Neto J A.Chagas disease. Lancet  
sos de infección reciente por Chagas congénito y de reactiva-  
2010;375:1388-402.  
ción chagásica por inmunosupresión [9]. El LoD obtenido se 7. Guías para la atención al paciente infectado con  
encuentra dentro del rango publicado, el cual abarca el intervalo  
Trypanosoma cruzi (Enfermedad de Chagas). Buenos  
0,005 – 5,000 parásitos/ml, al igual que el valor obtenido para  
Aires: Ministerio de Salud de la Nación, 2012.  
sensibilidad analítica expresada en masa de ADN, el cual, tam- 8. Murcia L, Carrilero B, Saura D, Iborra MA y Segovia M.  
bién, se halla dentro de los valores publicados (0,01 - 1,00 fg/μl)  
Diagnóstico y tratamiento de la enfermedad de Chagas. Enf  
[9]. En este aspecto, se destaca la optimización de las condicio-  
Inf Microbiol Clin 2013;31 Suppl 1:26-34.  
nes de reacción para adaptar las técnicas de biología molecular 9. Schijman AG, Bisio M, Orellana L, Sued M, Duffy T, Mejia  
a las condiciones de trabajo en este laboratorio.  
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