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Novedoso inmunoensayo multiplex por Citometría de Flujo para la detección simultánea y discriminativa  
de GADA e IA-2A en pacientes con Diabetes Mellitus  
ARTÍCULO ORIGINAL  
Novedoso inmunoensayo multiplex por Citometría de Flujo  
para la detección simultánea y discriminativa de GADA e IA-  
2
A en pacientes con Diabetes Mellitus  
1 1 1  
1
1
Guerra, Luciano Lucas ; Faccinetti, Natalia Inés ; Bombicino, Silvina Sonia ; Rovitto, Bruno David ; Sabljic, Adriana Victoria ;  
Trabucchi, Aldana ; Penas Steinhardt, Alberto ; Poskus, Edgardo ; Iacono, Ruben Francisco ; Valdez, Silvina Noemí .  
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1
1
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1*  
1Universidad de Buenos Aires, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Departamento de Microbiología, Inmunología, Biotecnología y Ge-  
nética, Cátedra de Inmunología. CONICET-Universidad de Buenos Aires, Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral “Prof. Ricardo A.  
Margni” (IDEHU)Cátedra de Inmunología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires (UBA), e Instituto de Estudios  
de la Inmunidad Humoral “Prof. Ricardo A. Margni” (IDEHU), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET-UBA).  
Contacto: Valdez, Silvina Noemí. Cátedra de Inmunología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires.  
Junín 956, 4to piso (C1113AAD) CABA; silval@ffyb.uba.ar, valdezsilvina@gmail.com  
Resumen  
La Diabetes Mellitus tipo 1 (DMT1) es un trastorno autoinmune con pérdida de tolerancia hacia antígenos  
de las células beta-pancreáticas y presenta autoanticuerpos en circulación dirigidos contra ellos. El objeti-  
vo de este trabajo fue desarrollar un inmunoensayo basado en Citometría de Flujo (CF) para la determina-  
ción combinada y discriminativa de los principales autoanticuerpos de DMT1: anti-glutamato decarboxilasa  
(
GADA) y anti-proteína tirosina fosfatasa IA-2 (IA-2A). Se emplearon 48 sueros de pacientes con DMT1. Para  
la CF, se inmovilizaron microesferas de 4 y 5 μm con cada uno de los autoantígenos recombinantes (TrxGAD  
y TrxIA-2 , respectivamente). Se incubó el suero con una mezcla de ambas microesferas, y se detectaron  
ic  
los inmunocomplejos con una mezcla de TrxGAD-biotina/TrxIA-2 -biotina, y luego 50,00 ng de estreptavidina-  
ic  
ficoeritrina. Los resultados obtenidos por la CF fueron contrastados con el ensayo de unión de radioligando  
(RBA). Se detectó GADA en un 52,1 % de sueros empleando RBA (SDsmediana 3,08 y rango (-0,85) - 42,26 SDs)  
y un 60,9 % con IA-2A (SDsmediana 6,39 y rango (-2,95) - 39,92 SDs), evidenciando un 77,1 % de muestras con  
componente autoinmune y 100 % de especificidad en ambos ensayos. Por CF, se detectó un 68,8 % de pacien-  
tes con GADA (SDsmediana 5,66 y rango (-1,89) - 124,10 SDs, sensibilidad analítica del 100 % y especificidad  
de 98 %) y un 41,7 % de IA-2A (SDsmediana 0,19 y rango (-2,08) - 62,07 SDs, 64,5 % de sensibilidad analítica  
y 93,9 % de especificidad). Se descubrió autoinmunidad en el 77,1 % de las muestras. Se logró desarrollar un  
inmunoensayo por CF que permitió la detección de autoinmunidad con el mismo desempeño que dos deter-  
minaciones independientes por RBA.  
Palabras clave: diabetes mellitus, citometría de flujo, autoinmunidad, autoanticuerpos, inmunoensayo.  
Abstract  
Type 1 Diabetes Mellitus (T1DM) is an autoimmune disorder with loss of tolerance to antigens of pancrea-  
tic beta-cells and presents circulating autoantibodies directed against them. The objective of this work was to  
develop an immunoassay based on Flow Cytometry (FC) for the combined and discriminative determination  
of the main T1DM markers: GADA and IA-2A. For FC, 4- and 5-μm-microspheres were immobilized with each of  
the recombinant autoantigens (TrxGAD and TrxIA-2 , respectively). The serum was incubated with a mixture  
ic  
of both microspheres, and the immunocomplexes were detected with a mixture of TrxGAD-biotin and TrxIA-2ic-  
biotin, and then 50,00 ng of streptavidin-phycoerythrin was added. The final mixture was acquired on a flow  
cytometer. The results obtained were compared with the reference method (RBA). GADA was detected in 52.1 %  
of sera using RBA (SDsmedian 3.08 and range (-0.85) - 42.26 SDs) and 60.9 % with IA-2A (SDsmedian 6.39 and  
range (-2.95) -39.92 SDs), evidencing 77.1 % of samples with autoimmunity and 100 % of specificity in both  
assays. By FC, 68.8 % of patients were detected with GADA (SDsmedian 5.66 and range (-1.89) - 124.10 SDs,  
analytical sensitivity of 100 % and specificity of 98 %) and 41.7 % with IA-2A (SDsmedian 0.19 and range (-2.08)  
ISSN 1515-6761 Ed. Impresa  
ISSN 2250-5903 Ed. CD-ROM  
Código Bibliográfico: RByPC  
Fecha de recepción:  
-
62.07 SDs, 64.5 % of analytical sensitivity and 93.9 % of specificity). Autoimmunity was detected in 77.1 % of  
the samples. It was possible to develop a FC-based immunoassay that allowed the detection of autoimmunity  
with the same performance as two independent RBA determinations.  
1
2/09/17  
Fecha de aceptación:  
7/11/17  
Keywords: diabetes mellitus, flow cytometry, autoimmunity, autoantibodies, immunoassay.  
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ByPC 2018;82(1):15-27.  
Novedoso inmunoensayo multiplex por Citometría de Flujo para la detección simultánea y discriminativa  
de GADA e IA-2A en pacientes con Diabetes Mellitus  
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Introducción  
La diabetes mellitus (DM) y sus complicaciones constitu-  
19], seguido por IA-2A (40 - 75 %) [19-24].  
Los estudios prospectivos y predictivos demostraron que los  
yen la tercera causa de muerte en los países industrializados, cuatro marcadores de autoinmunidad se asocian a la respuesta  
después de las enfermedades cardiovasculares y el cáncer. Al- celular autoagresiva de las células beta y se anticipan meses o  
rededor del 8,8 % de la población mundial padece alguna de las incluso años a la aparición de los primeros síntomas de la DM  
formas de esta enfermedad, la cual muestra una tendencia de [25-26], siendo el marcador IA-2A el que presentó el mayor va-  
crecimiento continuo [1]. Las estadísticas en Argentina mues- lor predictivo positivo (VPP) para evaluar el riesgo de evolución  
tran que en el país hay cerca del 7 % de la población con DM, a DMT1 [27]. Así, se encontró una vinculación entre el número  
aunque la prevalencia se eleva a un 20 % en aquellas personas de marcadores positivos en individuos asintomáticos dentro de  
mayores de 60 años. El 50 % de los afectados ignora que padece grupos de riesgo (familiares directos de pacientes diabéticos), y  
la enfermedad, lo que representa un serio problema en la salud la probabilidad de contraer la enfermedad en el transcurso de un  
pública nacional.  
período determinado [28]. Además, la determinación de estos  
La DM constituye un grupo heterogéneo de patologías, las marcadores de autoinmunidad en la población heterogénea, de  
cuales conducen a una elevación de la glucosa en sangre. Se pacientes debutantes en edad adulta, es de gran utilidad para  
distinguen dos tipos principales de la enfermedad, las que re- la asignación diagnóstica precisa de aquellos individuos que pa-  
quieren estudios y tratamientos diferentes: la DM Tipo 1 (DMT1) decen formas intermedias de DM autoinmune, no siempre bien  
y la DM Tipo 2 (DMT2). En algunos casos es difícil diferenciar caracterizadas, como por ejemplo los LADA. En este sentido, el  
entre las dos variantes principales de la enfermedad [2]. Así, se diagnóstico preciso de las diferentes formas de DM autoinmune  
han propuesto nuevas categorías, entre ellas, la diabetes auto- a través de la detección de los marcadores serológicos garanti-  
inmune latente del adulto (conocida como LADA por su sigla en za el inicio de un tratamiento precoz y adecuado, disminuyendo  
inglés), para identificar un subgrupo de pacientes adultos que las complicaciones crónicas de la enfermedad.  
poseen autoinmunidad e inicialmente no requieren insulina,  
pero pueden requerirla poco tiempo después del diagnóstico cadores de autoinmunidad, dada su baja concentración sérica,  
3]. Aunque los síntomas agudos y a veces letales de la DM es el ensayo de unión de radioligando (RBA), que emplea antí-  
El método de referencia para la detección sensible de los mar-  
[
pueden ser controlados, las complicaciones tardías de la enfer- genos recombinantes marcados radiactivamente [21-29,30].  
medad exhiben alta morbilidad y reducen significativamente las Si bien esta metodología es de gran sensibilidad y especificidad,  
expectativas de vida [4]. La aparición y progresión de las com- tiene la desventaja del uso de material radiactivo, el que provo-  
plicaciones tardías generan una pesada carga socioeconómica ca residuos contaminantes del medioambiente que requieren  
y de enfermedad (en términos de discapacidad y mortalidad) de un tratamiento especial para su descarte. Además, implica  
para la comunidad en general y para los distintos agentes del la necesidad de contar con personal e infraestructura edilicia  
sistema de salud.  
habilitados por la Autoridad Regulatoria Nuclear. Esto hace que  
La principal causa de la DMT2 o “DM del adulto” es una re- existan limitaciones operativas importantes que dificultan la  
sistencia de los tejidos periféricos a la acción de la insulina, implementación del método en forma rutinaria en laboratorios  
asociada a un grado variable de disfunción secretoria [5-8]. de mediana/baja complejidad, incluyendo, además, el alto costo  
Ambas causas, a su vez, se correlacionan con la presencia de de las determinaciones debido a la importación de los isótopos  
determinantes genéticos y factores ambientales, de ahí que radiactivos empleados en la generación de las moléculas anti-  
la DMT2 haya sido definida como una enfermedad poligénica y génicas marcadas.  
multifactorial.  
No existen en Argentina desarrollos locales de kits para el  
La DMT1 o “DM infanto juvenil” es un trastorno de origen auto- diagnóstico y seguimiento de la DM autoinmune, por lo cual el  
inmune que presenta un importante componente de autoagre- sistema de salud depende de su importación, lo que provoca  
sión celular, acompañado de una serie de marcadores humora- sustancialmente el costo de las determinaciones.  
les que sirven principalmente para la detección prodrómica y  
El objetivo del presente trabajo fue el desarrollo de un nove-  
para el apoyo diagnóstico [9-13]. Los principales marcadores doso inmunoensayo basado en Citometría de Flujo, para la de-  
de autoinmunidad asociados a DMT1 son los autoanticuerpos tección simultánea y discriminativa de los principales marcado-  
que reconocen a la GAD65 (denominados GADA), al dominio res de autoinmunidad asociados a DM autoinmune. Los marca-  
intracelular de IA-2 (denominados IA-2A), al transportador de dores seleccionados fueron GADA e IA-2A, ya que la combinación  
zinc 8 (denominados ZnT8A) y a los productos de secreción de en la detección de ambos autoanticuerpos permite detectar  
la célula β p ancreática: insulina (denominados IAA) y proinsulina la presencia del componente autoinmune en el 85-90 % de los  
(denominados PAA) [14]. Aparte de éstos, fueron identificados pacientes debutantes con DMT1, y la presencia de estos dos  
otros autoantígenos, pero ninguno de los anticuerpos induci- marcadores positivos en el grupo de riesgo determina un VPP  
dos por ellos resultó tener suficiente relevancia para el apoyo del 100 % en un período de evolución de 5 años.  
diagnóstico y la predicción de la enfermedad [15]. Analizados  
en conjunto, más del 90 % de los pacientes infanto-juveniles de-  
butantes con DMT1 presentan uno o más de los marcadores prin-  
cipales [16], siendo GADA el de mayor prevalencia (70 - 90 %) [17-  
ByPC 2018;82(1):15-27.  
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Novedoso inmunoensayo multiplex por Citometría de Flujo para la detección simultánea y discriminativa  
de GADA e IA-2A en pacientes con Diabetes Mellitus  
Materiales y métodos  
Colección de sueros  
Pacientes argentinos con Diabetes Mellitus Tipo 1  
Se colectaron muestras de suero (n = 48, edad media de 9,2  
años con edad mediana de 9 años, rango etario 2 a 21 y sexo  
masculino/femenino: 23/37), de niños y adolescentes argenti-  
da o 5-7 % de [35S]IA-2 , produciendo aproximadamente 5-7x106  
dpm de esta. Los trazadores se almacenaron en alícuotas a  
-40°C, y tuvieron una vida útil de 5 semanas.  
Protocolo de RBA para la detección de GADA o IA-2A  
Los protocolos de RBA se realizaron como se describió an-  
nos ingresados al Servicio de Nutrición del Hospital Nacional de teriormente [21-30], con modificaciones menores [32-34].  
Pediatría “Ricardo Gutiérrez”, Buenos Aires, Argentina, de mayo Brevemente, se incubaron 2,5 μL de suero humano durante la  
35  
35  
de 2013 a marzo de 2015. Se tomaron muestras de pacientes noche a 4°C con 10.000 dpm de [ S]GAD o [ S]IA-2 en un vo-  
con ayuno de 8 h, antes o dentro de las 72 h del inicio del tra- lumen final de 60 μL en buffer RBA. A continuación, se añadieron  
tamiento con insulina. La DMT1 fue diagnosticada de acuerdo 50 μL de proteína A-Sepharose 4B FF (GE Healthcare Bioscien-  
con los criterios de la OMS [31]. La colección de muestras y los ces, Uppsala, Sweeden) 40 % V/V en buffer RBA para aislar los  
protocolos fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital inmunocomplejos y se incubaron 2 h a temperatura ambiente  
Nacional de Pediatría “Ricardo Gutiérrez”. Se obtuvo el consenti- en agitación. Posteriormente, las muestras se dejaron sedimen-  
miento de los padres. Los sueros se almacenaron a -20°C hasta tar y los sobrenadantes se descartaron. Los pellets se lavaron  
que se ensayaron. Se sometieron al análisis del perfil de autoan- tres veces con 200 μL de buffer RBA y una vez con 200 μL de  
ticuerpos GADA e IA-2A por el método de referencia RBA. Es así NaCl 200 mM en buffer RBA. Finalmente, los pellets se resuspen-  
que se determinó por separado la presencia de GADA e IA-2A con dieron en 100 μL de SDS 1 % P/V, se dejó decantar la proteína A-  
el objetivo de obtener 4 grupos experimentales discriminados Sepharose y los sobrenadantes se transfirieron cuidadosamen-  
según la presencia (+) o ausencia (-) del marcador (GADA/IA-2A): te a viales para su lectura en un contador de centelleo líquido  
+
/+; +/-; -/+ y -/-.  
(Liquid Scintillation Analyzer Modelo 1600TR, Packard, Canbe-  
rra, Australia) por 1 min/vial. Los resultados para cada muestra  
se calcularon como porcentaje de unión (B%):  
Individuos controles normales  
Se obtuvieron sueros (n = 115, edad media de 29,7 años  
con mediana de 25 años, rango etario 16 a 80 y sexo mascu-  
lino/femenino: 58/57) de individuos sanos argentinos sin  
antecedentes personales o familiares de DM o enfermedades  
autoinmunes, para ser utilizados como controles normales. La  
colección de muestras fue aprobada por el Comité de Ética del  
Hospital de Clínicas “José de San Martín” de la Universidad de  
Buenos Aires (UBA), Buenos Aires, Argentina. Todos los sujetos  
fueron informados sobre el propósito del estudio y se obtuvo el  
consentimiento firmado para la participación en el mismo. Los  
sueros se almacenaron a -20°C hasta que se ensayaron. Se rea-  
lizó la evaluación de autoanticuerpos (GADA, IA-2A, IAA y ZnT8A)  
por RBA y todos los individuos resultaron negativos.  
Y se expresaron como scores de desvío estándar (SDs, por  
sus siglas en inglés, standard deviation scores):  
Donde B % es el B% medio de sueros de individuos contro-  
c
les y DE su desvío estándar. Se procesaron simultáneamente  
c
sueros de individuos controles normales para calcular el cut-  
off. Las muestras se consideraron positivas cuando SDs > 3,0.  
El ensayo para GADA mostró un 79,6 % de sensibilidad y 98 %  
de especificidad en el Diabetes Autoantibody Standardization  
Program (DASP) 2007 y, el RBA para IA-2A obtuvo un 66,0% de  
sensibilidad, 97,8 % de especificidad y 86,43 % de precisión en  
el Islet Autoantibody Standardization Program (IASP) 2015, la-  
boratorio 0519.  
Detección de GADA o IA-2A por el ensayo de unión de radioli-  
gando o Radioligand Binding Assay (RBA)  
Producción de los trazadores [ S]GAD y [35S]IA-2  
35  
Los trazadores se obtuvieron con alto grado de pureza por  
transcripción/traducción in vitro del ADN codificante, ya sea  
para la GAD humana clonado en el vector pEX9 o el fragmento in-  
tracelular de IA-2(IA-2 ) humano (residuos 604-979) clonado  
IC  
Flow Cytometric Microsphere-based Immunoassay (FloCMIA)  
para la detección simultánea de GADA e IA-2A o FloCMIA mul-  
tiplex  
en el vector pSP64 (Promega, Madison, WI, EE.UU.), usando un  
sistema de lisado de reticulocitos de conejo (Promega, Madison,  
35  
WI, EE.UU.) en presencia de [ S]-metionina (New England, Nu-  
clear , Boston, MA, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del  
fabricante. Los productos de traducción se diluyeron en buffer  
RBA (Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 0,1 % V/V, pH 7,4)  
y se sembraron en una columna PD10 (Pharmacia-LKB Biotech-  
Expresión, purificación y biotinilación de las proteínas  
recombinantes TrxGAD y TrxIA-2ic  
Las proteínas recombinantes GAD e IA-2 fueron expresadas  
ic  
en E. coli como proteínas de fusión con tiorredoxina (TrxGAD y  
TrxIA-2 , respectivamente) como se describió previamente [35,  
ic  
35  
nology, Uppsala, Suecia) para eliminar la [ S]-Metionina libre.  
36]. Brevemente, las cepas GI698 y GI724 de E. coli se transfor-  
35  
Típicamente, el porcentaje de incorporación de [ S]-metionina  
maron con los plásmidos recombinantes pTrxGAD65, que posee  
el ADN codificante para la isoforma de 65 kDa de la GAD humana,  
35  
a las proteínas por este método fue de 15 % para [ S]GAD, pro-  
6
duciendo aproximadamente 5-10x10 dpm de proteína marca-  
y pTrxIA-2 , que codifica para el fragmento intracelular de IA-2  
ic  
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Novedoso inmunoensayo multiplex por Citometría de Flujo para la detección simultánea y discriminativa  
de GADA e IA-2A en pacientes con Diabetes Mellitus  
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humana (residuos 604 a 979), respectivamente. Las bacterias a 10.000 rpm durante 10 min a 4°C y los sobrenadantes se des-  
se cultivaron a 30°C con casaminoácidos 0,2 % P/V, glucosa 0,5 % cartaron. Para bloquear los sitios libres sobre la microesfera, los  
P/V, MgCl 1 mM y ampicilina 100 μg/mL. Se indujo la expresión pellets se re suspendieron con 200 μL de una solución de se-  
2
proteica con 100 μg/mL de triptófano a 20°C para la cepa GI698 roalbúminabovina (BSA) 0,5 % P/V en IBS y se incubaron durante  
o 37°C para la cepa GI724. Se realizó una centrifugación de 200 1 h a temperatura ambiente en agitación. Las preparaciones se  
mL del cultivo bacteriano, se resuspendió el pellet resultante en centrifugaron de nuevo a 10.000 rpm durante 10 min a 4°C, el  
2
mL de buffer de lisis (Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, sobrenadante se desechó y el pellet se lavó con 400 μL de PBS.  
pH 7,0) y la suspensión resultante se sonicó en presencia de Finalmente, se añadieron otros 400 μL de PBS (resultando en  
5
-mercaptoetanol (2ME) 1 mM e inhibidores de proteasa (apro- 1x10 microesferas - TrxGAD o TrxIA-2 /μL) y la suspensión se  
ic  
2
tinina 0,1 % P/V y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 2 mM) sobre hie- almacenó a 4°C.  
lo triturado (5 ciclos de 30 s). Después de la sonicación, se aña-  
dió a la suspensión resultante Triton X-100 a una concentración  
final de 0,1 % V/V y se incubó durante 10 min a 0°C. Luego, se  
separó la fracción soluble intracelular (FSI) por centrifugación a  
Protocolo de FloCMIA multiplex para la detección  
simultánea y discriminativa de GADA e IA-2A  
Excepto cuando se indica de otro modo, todas las etapas de  
lavado se realizaron con 200 μL de PBS-Tween 20 0,05 % V/V en  
15.000 rpm durante 10 min.  
Las proteínas de fusión se purificaron por cromatografía de el MultiscreenHTS vacuum manifold, y las diluciones de los reac-  
afinidad siguiendo el protocolo previamente descripto [36, 37]. tivos se prepararon utilizando BSA 0,5 % P/V, Tween 20 0,05 % V/V  
La resina se basó en un soporte de agarosa modificado cova- en PBS y se agregaron 50 μL de volumen de reactivos por pocillo  
lentemente con óxido de fenilarsina, que permitió la unión de en cada incubación. Veinte microlitros de suero humano puro  
proteínas que contenían residuos de ditiol vecinales, tal como se mezclaron con 20 μL de una suspensión conteniendo una  
3
la Trx (38]. Se añadió la FSI (4 mL), proveniente de la cepa de E. mezcla de microesferas-TrxGAD (1,7x10 microesferas /μL) y  
3
coli que corresponda, a dicha resina (≈4 mL), previamente equi- microesferas-TrxIA-2 (2,5x10 microesferas/μL), en una placa  
ic  
librada en buffer de lisis y activada con 4 volúmenes de columna de filtración MultiscreenHTS-HV de 96 pocillos. La incubación se  
(
VC) de 2ME 20 mM en buffer de lisis, y se incubó la suspensión realizó durante la noche a 4°C en agitación. Después de ésta, la  
resultante durante 1,5 horas a 4°C. La resina se vertió en una placa de filtración se lavó 5 veces. La detección de los anticuer-  
columna y se lavó secuencialmente con 6 V de buffer de lisis, pos GADA e IA-2A unidos requirió una incubación en dos etapas  
C
6
V de 2ME 1 mM en buffer de lisis y con 3 V de 2ME 5 mM en (1 h a temperatura ambiente cada una, con 5 lavados entre  
C C  
buffer de lisis. Las proteínas unidas se eluyeron de la resina con ellas): i), se añadió una mezcla de 1,15 ng de TrxGAD-biotina y  
varias alícuotas de 2 mL de 2ME 100 mM en buffer de lisis. Las 2,75 ng de TrxIA-2 -biotina y ii) 50,00 ng de estreptavidina-PE  
ic  
preparaciones típicas de TrxGAD y TrxIA-2 proporcionaron ≈10 (Affimetrix eBioscience, San Diego, CA, EE. UU.) para la detección  
ic  
mg de proteína recombinante por Litro de cultivo.  
simultánea de las moléculas de TrxGAD-biotina y TrxIA-2 -bioti-  
ic  
Dos mililitros de cada proteína de fusión purificada por afi- na unidas. Después de este paso, la placa se lavó 4 veces, más  
nidad se sometieron a intercambio de buffer a buffer fosfato 1 etapa final de lavado con 200 μL de PBS y las microesferas se  
salino (PBS, KH PO 1,5 mM, Na HPO 8,1 mM, NaCl 140 mM, resuspendieron con otros 200 μL de PBS. Se realizó la transfe-  
2
4
2
4
KCl 2,7 mM, pH 7,4) utilizando una columna de desalinización rencia de la suspensión a tubos de Röhren y se adquirió en un  
ZEBA (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EE.UU.), de acuerdo citómetro de flujo PAS III PARTEC. Las muestras se analizaron uti-  
con las instrucciones del fabricante. La proteína en PBS se in- lizando el software Cyflogic, se identificó la población de single-  
cubó luego durante 2 h a 0°C con 0,32 mg de sulfo-NHS-biotina tes de microesferas por gating en un dot plot de Forward Scatter  
(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EE.UU.) y se retiró la biotina (FSC) vs. Side Scatter (SSC) discriminando ambas poblaciones  
libre con una nueva columna de desalinización ZEBA.  
de microesferas por su tamaño, las señales de fluorescencia se  
midieron en el canal FL2 y se informaron como Media Geomé-  
trica de la Intensidad de Fluorescencia (GeoM) (Figura 1). Los  
Protocolo de adsorción pasiva  
Este protocolo se realizó siguiendo las instrucciones del fa- resultados se expresaron como SDs:  
bricante con modificaciones menores. Se mezcló 28 μg de una  
preparación purificada de TrxGAD por cada 100 cm2 de microes-  
feras (36,4 μL de suspensión de microesferas de 4 μm 5% P/V,  
Spherotech, Inc., Lake Forest, IL, EE.UU.) con 60 μg de una pre-  
paración purificada de TrxIA-2ic por cada 100 cm2 de microes-  
Donde GeoMm es la GeoM media de las muestras por duplica-  
do, GeoM es la GeoM media de los sueros de individuos controles  
feras (64,0 μL de suspensión de microesferas de 5 μm 5% P/V).  
Se empleó una alícuota almacenada con 2ME 50 mM, glice-  
rol 50 % y aprotinina 0,1 % P/V, en un volumen final de 220  
μL en buffer isotónico salino (IBS, isotonic buffered saline)  
c
normales y DE su desvío estándar. Se consideraron como mues-  
c
tras GADA positivas cuando SDs > 2,5, e IA-2A positivas cuando  
SD > 3,0. Se calcularon los valores de CV en determinaciones por  
duplicado para SDs bajas, medias y altas. Para la determinación  
de GADA, el CV intraensayo fue de 9,8 % a SDs = 43,89. Los CV in-  
terensayo resultaron en 6,3 % a SDs = 8,80, 4,0 % a SDs = 57,30 y  
(
NaH PO4 2,3 mM, Na HPO 14,2 mM, NaCl 140 mM, KCl 3,8  
2 2 4  
mM, azida de sodio 3,1 mM). Luego de una incubación durante  
la noche a 4°C en agitación, las preparaciones se centrifugaron  
ByPC 2018;82(1):15-27.  
18  
Novedoso inmunoensayo multiplex por Citometría de Flujo para la detección simultánea y discriminativa  
de GADA e IA-2A en pacientes con Diabetes Mellitus  
Resultados  
Detección de GADA e IA-2A por RBA  
Tabla I. Parámetros analíticos para los métodos de RBA y  
FloCMIA multiplex aplicados a la determinación del marca-  
Mediante la determinación de GADA por el método de referencia,  
de los 48 sueros de pacientes con DMT1, 25 muestras resultaron  
positivas para la presencia de dicho marcador (52,1 %), empleando  
un cut-off de SDs > 3,0 (Figura 2 (A)). Los niveles de autoanticuer-  
pos se caracterizaron por presentar una SDsmediana = 3,08 y un  
rango de señales de -0,85 a 42,26 (Tabla I). Por otro lado, al ana-  
lizar la presencia de IA-2A en esta misma población, 28 muestras  
resultaron positivas para dicho marcador (60,9 %) empleando un  
cut-off de SDs > 3,0 (Figura 2 (B)). Los parámetros observados  
para este ensayo incluyeron una SDsmediana = 6,39 y un rango de  
señales de -2,95 a 39,92 (Tabla II). El análisis en paralelo de 24  
sueros de individuos controles normales confirmó una especifi-  
cidad del 100 % en ambos ensayos. Frente al análisis en conjun-  
to de estos resultados puede decirse que se detectó el compo-  
nente autoinmune (definido como presencia de GADA y/o IA-2A  
en suero) en una cantidad de 37 muestras de pacientes con  
reciente diagnóstico de DMT1 (77,1 %). Además, seestablecieron  
así 4 cuatros grupos experimentales (GADA/IA-2A): +/+ (n = 16), +/-  
dor humoral GADA. Los resultados se obtuvieron del análi-  
sis de una población de individuos controles normales y  
de pacientes infanto-juveniles con reciente diagnóstico de  
DMT1.  
Inmunoensayo  
Mediana  
RBA  
,08  
FloCMIA multiplex  
5,66  
3
(
SDs)  
Rango  
SDs)  
(
-0,85)-42,26  
(-1,89)-124,10  
68,8  
(
Sensibilidad  
a
52,1  
(
%)  
Sensibilidad  
Analítica (%)  
-
100,0  
b
(
n = 9), -/+ (n =12) y -/- (n = 11) (Figura 2 (C)); los cuales se  
1
00,0  
98,0  
c
(
%)  
sometieron al análisis por el método FloCMIA multiplex.  
ꢀa: Porcentaje de pacientes positivos para GADA del total de pacientes  
Detección de GADA e IA-2A por FloCMIA multiplex  
estudiados  
b: Porcentaje de pacientes positivos para GADA por RBA que fueron  
positivos por FloCMIA  
c: 100% menos el porcentaje de falsos positivos  
Mediante la determinación de GADA por FloCMIA multiplex  
Figura 3 (A)), de los 48 sueros de pacientes con DMT1, 33  
muestras resultaron positivas para la presencia de dicho mar-  
(
cador (68,8%) empleando un cut-off de SDs > 2,5. Los niveles de  
1
,6 % a SDs = 122,67. Por otro lado, para la determinación de IA-2A,  
los CV intraensayo fueron de 2,0 % a SDs = 7,36 y 9,8 % a SDs = 13,16.  
Los CV interensayo resultaron en 2,1 % a SDs = 6,75, 11,3 % a  
SDs =10,85 y 10,7 % a SDs = 57,69.  
Tabla II. Parámetros analíticos para los métodos de RBA y  
FloCMIA multiplex aplicados a la determinación del marca-  
dor humoral IA-2A. Los resultados se obtuvieron del análi-  
sis de una población de individuos controles normales y  
de pacientes infanto-juveniles con reciente diagnóstico de  
DMT1.  
Análisis estadístico  
La distribución normal de los datos se analizó mediante el  
test de normalidad Omnibus de D’Agostino & Pearson. Se realizó  
el test de Rout con el fin de eliminar los valores outliers dentro de  
la población de individuos control normalmente distribuidos. La  
selección de valores óptimos de cut-off se basó en curvas cons-  
truidas trazando la especificidad calculada y la sensibilidad de  
cada protocolo frente a los valores de corte correspondientes.  
La significación estadística se evaluó mediante tests paramé-  
tricos: test t de Student para muestras no pareadas con correc-  
ción de Welch; o tests no paramétricos: test U de Mann-Whitney  
para datos no pareados, cuando fuese aplicable. La correlación  
entre ensayos se evaluó mediante regresión lineal estándar y  
con el cálculo del coeficiente de correlación de Spearman (rs).  
Los cálculos se realizaron utilizando GraphPad Prism versión  
Inmunoensayo  
Mediana  
RBA  
,39  
FloCMIA multiplex  
6
0,19  
(SDs)  
Rango  
(
-2,95)-39,92  
(-2,08)-62,07  
41,7  
(
SDs)  
Sensibilidad  
a
60,9  
(
%)  
Sensibilidad  
Analítica (%)  
-
64,5  
b
6
.01 para Windows (GraphPad Software, San Diego California,  
100,0  
93,9  
c
EE.UU., www.graphpad.com). Se consideró estadísticamente  
(%)  
significativo un valor de p < 0,05.  
ꢀa: Porcentaje de pacientes positivos para IA-2A del total de pacientes  
estudiados  
b: Porcentaje de pacientes positivos para IA-2A por RBA que fueron  
positivos por FloCMIA  
c: 100% menos el porcentaje de falsos positivos  
ByPC 2018;82(1):15-27.  
Novedoso inmunoensayo multiplex por Citometría de Flujo para la detección simultánea y discriminativa  
de GADA e IA-2A en pacientes con Diabetes Mellitus  
19  
Figura 1. Evaluación de sueros por FloCMIA mutiplex. A: Poblaciones de microesferas de 4 μm-TrxGAD (izquierda) y 5 μm-  
TrxIA-2ic (derecha) observadas en el dot plot FSC vs. SSC para propósitos de gating, B-E: dot plots para el análisis de la  
intensidad de fluorescencia adquirida en el canal FL2 vs. FSC. Se muestran señales representativas para los sueros de  
pacientes diabéticos tipo 1 con diferente perfil de detección de autoanticuerpos. B: suero GADA-/IA-2A-, C: suero GADA-/  
IA-2A+, D: suero GADA+/IA-2A+ y E: suero GADA+/IA-2A-.  
A.  
B.  
C.  
D.  
E.  
FORWARD S CATTER(FSC)  
FORWARDS CATTER(FSC)  
Figura 2. Resultados obtenidos por RBA para la determinación de GADA (A) e IA-2A (B) en el suero de individuos controles  
normales y pacientes con DMT1. El valor de cut-off para cada ensayo es indicado por una línea punteada y las media-  
nas para cada población están indicadas por una línea discontinua. **** p < 0,0001 estadísticamente significativo. C:  
Diagrama de Venn para resultados obtenidos en la determinación de GADA e IA-2A por RBA, sobre una población de 48  
pacientes infanto-juveniles con reciente diagnóstico de DMT1. En este diagrama se establecen 4 grupos experimentales  
según la presencia (+) o ausencia (-) del marcador correspondiente.  
A.  
5
B.  
45  
40  
3
C.  
0
0
0
0
0
0
****  
GADA  
IA-2A  
****  
5
0
4
3
2
1
2
1
5
0
5
0
+
/- +/+ -/+  
16 12  
1
9
-
/- 11  
-5  
Individuos  
Pacientes  
Individuos  
Pacientes  
Controles  
n = 24  
con DMT1  
n = 48  
Controles  
n = 24  
con DMT1  
n = 48  
autoanticuerpos se caracterizaron con una SDsmediana = 5,66 y Resultados integrados y análisis de correlación  
un rango de señales de -1,89 a 124,10 (Tabla I). La sensibilidad El diagrama de Venn (Figura 4 (A)) ilustra los resultados inte-  
analítica fue del 100,0 %, mientras que el análisis en paralelo grados de la determinación de GADA por RBA y FloCMIA multiplex.  
de 49 sueros de individuos controles normales determinó una Del análisis de las 48 muestras de pacientes con DMT1, 25 sue-  
especificidad de 98,0 % con la eliminación de una muestra con ros fueron positivos por ambos métodos (52,1 %), mientras que  
señal outlier para el cálculo del cut-off. Por otro lado, al analizar 15 resultaron negativos por ambos ensayos (31,3 %). Se desta-  
la presencia de IA-2A en esta misma población (Figura 3 (B)), ca que el método FloCMIA fue capaz de determinar la presencia  
20 muestras resultaron positivas para dicho marcador (41,7 %) del marcador en 8 sueros que el RBA no pudo. Frente al análisis  
empleando un cut-off de SDs > 3,0. Los parámetros observados de regresión lineal y correlación entre las determinaciones de GADA  
para este ensayo incluyeron una SDsmediana = 0,19, un rango por RBA y aquellas realizadas en paralelo por FloCMIA, los paráme-  
2
de señales de -2,08 a 62,07 y una sensibilidad analítica de tros estadísticos obtenidos fueron: R = 0,6481, r = 0,8137 para  
s
6
4,5 % (Tabla II). El análisis en paralelo de 49 sueros de indivi- RBA y FloCMIA multiplex (Figura 5 (A)). Es así, que la regresión  
duos controles normales confirmó una especificidad de 93,9 lineal es buena y la correlación entre métodos para determinar  
con la eliminación de 3 muestras con señales outlier para el GADA es real y no por muestreo azaroso.  
cálculo del cut-off. Frente al análisis en conjunto de estos resul- Luego del análisis de los resultados integrados de la determi-  
%
tados puede decirse que se detectó el componente autoinmune nación de IA-2A por RBA y FloCMIA multiplex en las 48 muestras  
en una cantidad de 37 muestras de pacientes con reciente diag- de pacientes con DMT1 se pudo observar que 20 sueros fueron  
nóstico de DMT1 (77,1 %), discriminado en 4 grupos experimen- positivos por los dos métodos (41,7 %), mientras que otros 20  
tales (Figura 3 (C))  
resultaron negativos por ambos (41,7 %) (Figura 4 (B)). El RBA  
ByPC 2018;82(1):15-27.  
20  
Novedoso inmunoensayo multiplex por Citometría de Flujo para la detección simultánea y discriminativa  
de GADA e IA-2A en pacientes con Diabetes Mellitus  
fue capaz de detectar como positivas a 8 muestras que el di- Discusión  
seño multiplex de FloCMIA no pudo establecer como positivas.  
La problemática actual en el apoyo diagnóstico diabetológi-  
Cuando se analizaron la regresión lineal y la correlación entre las co se puede resumir en ciertos aspectos críticos que han podido  
determinaciones de IA-2A por RBA frente a las determinaciones ser subsanados en este trabajo:  
realizadas en paralelo por FloCMIA, los parámetros estadísticos I. Necesidad de gran cantidad de masa de antígeno: se cuenta  
2
obtenidos fueron: R = 0,3110, r = 0,7776 para RBA y FloCMIA  
con dos autoantígenos expresados de manera recombinan-  
te en E. coli en gran cantidad, correctamente plegados, de  
fácil purificación y alto rendimiento; con ellos se han podido  
desarrollar un gran número de inmunoensayos y permite su  
aplicación en determinaciones rutinarias.  
s
multiplex (Figura 5 (B)). Es así, que si bien la regresión lineal no  
es buena, la correlación entre métodos para determinar IA-2A es  
real (las señales obtenidas por ambos métodos tienden a au-  
2
mentar paralelamente). El menor valor de R obtenido en la re-  
gresión lineal del FloCMIA para IA-2A puede observarse en la pér- II. Metodologías radiométricas costosas: se pudieron imple-  
dida de linealidad a medida que aumenta el valor de las señales. mentar exitosamente protocolos de FloCMIA con insumos  
Figura 3. Resultados obtenidos por FloCMIA multiplex para la determinación de GADA (A) e IA-2A (B) en el suero de indivi-  
duos controles normales y pacientes con DMT1. El valor de cut-off para cada ensayo es indicado por una línea punteada y  
las medianas para cada población están indicadas por una línea discontinua. **** p < 0,0001 estadísticamente significa-  
tivo. C: Diagrama de Venn para resultados obtenidos en la determinación de GADA e IA-2A por FloCMIA multiplex, sobre una  
población de 48 pacientes infanto-juveniles con reciente diagnóstico de DMT1. En este diagrama se establecen 4 grupos  
experimentales según la presencia (+) o ausencia (-) del marcador correspondiente.  
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Individuos  
Controles  
n � 4�  
Pacientes  
con DMT1  
n � 4�  
Individuos  
Controles  
n � 4�  
Pacientes  
con DMT1  
n � 4�  
Figura 4. Diagramas de Venn de los resultados integrados en la determinación de GADA (A) e IA-2A (B) en 48 sueros de  
pacientes infanto-juveniles con reciente diagnóstico de DMT1, realizado por RBA y FloCMIA multiplex.  
ByPC 2018;82(1):15-27.  
Novedoso inmunoensayo multiplex por Citometría de Flujo para la detección simultánea y discriminativa  
de GADA e IA-2A en pacientes con Diabetes Mellitus  
21  
Figura 5. Correlación de señales obtenidas por el método FloCMIA multiplex desarrollado para GADA (A) o IA-2A (B), y  
el método de referencia para el mismo marcador humoral en 48 sueros de pacientes diabéticos infanto-juveniles con  
reciente diagnóstico de DMT1 seleccionados. La línea punteada representa el valor de cut-off para cada uno de los en-  
2
sayos. Cada gráfico incluye los parámetros correspondientes a la regresión lineal (R ) y correlación determinada por el  
s
coeficiente de Spearman (r ).  
mucho más estables y productivos para la evaluación y se-  
gran utilidad para predicción y prevención de la DMT1.  
guimiento de un gran número de muestras, con potencial be- III. La combinación de la determinación de GADA e IA-2A ha de-  
neficio económico del paciente y el sistema de salud.  
III. Aplicabilidad en laboratorios de baja-media complejidad: el  
equipamiento más costoso es el citómetro de flujo, el cual ya  
ha sido adquirido en la gran mayoría de los hospitales públi-  
cos y privados de los centros urbanos más importantes del  
mostrado detectar el componente autoinmune en la mayor  
parte de los pacientes infanto-juveniles con DMT1A (donde  
presentan alta prevalencia) y además posee un valor predic-  
tivo positivo > 90 % al estudiar a la población de riesgo [27].  
Se seleccionaron 48 muestras de pacientes con DMT1 de  
país, y no requiere mucha más infraestructura específica ni reciente diagnóstico para ser evaluadas por RBA y el diseño  
habilitaciones rigurosas.  
multiplex de FloCMIA. A partir de los resultados obtenidos por  
IV. Desafío analítico por la baja concentración de autoanticuer- el método de referencia se crearon 4 grupos experimentales  
pos: se desarrollaron métodos con detección de alta sensi- según la presencia (+) o ausencia (-) de los marcadores GADA  
bilidad, como es la fluorescencia, que permitieron distinguir e IA-2A (+/+, +/-, -/+ y -/-), los cuales se sometieron posterior-  
adecuadamente la diferencia en señales de pacientes e in- mente a la evaluación por FloCMIA multiplex, para el análisis de  
dividuos normales.  
la performance analítica con el objetivo de demostrar que los  
Todos estos aspectos permiten considerar al FloCMIA mul- métodos radiométricos pueden ser reemplazados en la prác-  
tiplex para la determinación de GADA e IA-2A como método de tica clínica de apoyo diagnóstico diabetológico. Como era de  
screening de primera línea en distintas poblaciones. Si bien no esperar, empleando el RBA no todos los individuos mostraron  
poseen una performance superadora con respecto al método evidencia de autoinmunidad (37 pacientes presentaron como  
de referencia, al ser un método combinado y discriminativo mínimo uno de los marcadores humorales mencionados), aún  
aumenta su importancia diagnóstica. Por lo tanto, teniendo en siendo este el método de referencia. El análisis conjunto de los  
cuenta que:  
resultados supera al alcance diagnóstico de la determinación  
I. FloCMIA GADA se desarrolló utilizando microesferas de 4 μm individual de cada autoanticuerpo (25 muestras positivas para  
como fase sólida, mientras que FloCMIA IA-2A se optimizó GADA y 28 para IA-2A). Esto coincide con la recomendación de  
con microesferas de 5 μm, ambas pueden combinarse en un determinar más un marcador para disminuir la posibilidad de  
mismo pocillo de reacción y ser distinguidas en un citómetro informar al paciente un resultado negativo para la presencia  
de flujo gracias a la señales diferenciables que se obtienen de autoinmunidad, con la consiguiente falla terapéutica. Esto  
por FSC.  
es de suma importancia en pacientes adultos, donde si no se  
II. La detección simultánea permite realizar el screening y se- demuestra el componente autoinmune no se comienza el tra-  
guimiento de un gran número de pacientes [34-39-41], con tamiento sustitutivo con insulina, perjudicando así a los islotes  
ByPC 2018;82(1):15-27.  
22  
Novedoso inmunoensayo multiplex por Citometría de Flujo para la detección simultánea y discriminativa  
de GADA e IA-2A en pacientes con Diabetes Mellitus  
de Langerhans residuales al sobreexigir la liberación de dicha  
hormona para mantener los niveles normales de glucosa en  
sangre perpetuando y acelerando el daño autoinmune. Incluso,  
si se establece una terapia con secretagogos de insulina (como  
las sulfonilureas) el cuadro se agrava aún más, precipitando el  
debut de la DM autoinmune con cetoacidosis. Actualmente, está  
contraindicado el empleo de sulfonilureas en pacientes con pre-  
sencia de autoanticuerpos en circulación y diagnóstico de DM  
no insulino-requiriente; de hecho se propone el uso de inhibido-  
res de la dipeptidil peptidasa-4 (DPP-4) o insulina para mejorar  
el control glucémico en ellos [42].  
Figura 6. Diagrama de Venn para los resultados integrados  
en la determinación de componente autoinmune (presen-  
cia de GADA y/o IA-2A) en 48 sueros de pacientes infanto-  
juveniles con reciente diagnóstico de DMT1, realizado por  
RBA y FloCMIA multiplex.  
El análisis de regresión lineal y correlación entre las determi-  
naciones de GADA por RBA y FloCMIA multiplex muestra que se  
relacionan linealmente y correlacionan de manera adecuada,  
rechazando la idea de que la correlación es debida a casualidad.  
Esto reafirma la idea de poder reemplazar el método radiométri-  
co individual para la determinación de GADA por FloCMIA. Aunque  
posean principios fisicoquímicos diferentes, es evidente que el  
método FloCMIA posee características más cercanas a la fase  
fluida que los métodos en fase sólida clásicos, probablemente  
debido a que el pequeño tamaño de las microesferas, sumado  
a la incubación durante toda la noche del suero con las mismas  
III. Aumentar la aplicabilidad de estos métodos en laboratorios  
de mediana complejidad que posean un citómetro de flujo  
con pocos requerimientos,  
IV. Descentralizar las determinaciones de marcadores humora-  
les, como consecuencia del punto anterior,  
(tiempo suficiente para alcanzar un estado cercano al equilibrio  
químico), podría constituir una “fase fluida virtual”.  
Por otro lado, al analizar la regresión lineal entre las determi-  
naciones de IA-2A por RBA y FloCMIA multiplex se observa que no  
existe buena relación lineal evidenciada por los valores bajos de  
V. Lograr una mejora en el diagnóstico del componente autoin-  
mune, análogo al método de referencia,  
VI. Mejorar la terapia una vez conocido el proceso autoinmune  
subyacente, ayudando incluso al médico clínico no especia-  
lizado en diabetología (si no está seguro que análisis pedir al  
laboratorio, puede pedir la realización del FloCMIA multiplex y  
así aumentar las posibilidades de acceder a un diagnóstico  
correcto),  
VII. Disminuir el uso de material radiactivo eliminando la nece-  
sidad de tratar los desechos generados, pedir autorización a  
la autoridad regulatoria competente, formar personal con en-  
trenamiento específico y autorizado, y disminuir los costos  
2
R obtenidos. A priori, esto podría deberse a que el método FloCMIA  
para IA-2A posee valores más altos de CV que aquellos para GADA  
al determinar alto títulos del marcador, lo cual produce un desvío  
de la linealidad. Como ambos métodos poseen principios fisico-  
químicos diferentes no se esperaba una relación lineal ideal, y  
además el objetivo final es determinar presencia y ausencia del  
marcador, no tanto así su semicuantificación, por lo que no es  
tan crítica la falta de relación lineal entre señales sino que se de-  
tecte la presencia de IA-2A. Los métodos correlacionan de ma-  
nera adecuada, indicando que cuando aumentan las señales  
por RBA también se observa el aumento por FloCMIA (análisis  
Figura 7. Histograma de sensibilidad para los marcadores  
GADA, IA-2A, IAA y ZnT8A en comparación con el FloCMIA  
multiplex en 48 pacientes con DMT1.  
de r ). Si bien las determinaciones individuales por FloCMIA no  
s
superan en performance al RBA, cuando se analiza la cantidad  
de pacientes con componente autoinmune demostrado por  
FloCMIA GADA e IA-2A a través del diseño multiplex se obtiene  
prácticamente el mismo número que aquellos detectados por  
RBA (Figura 6).  
100  
80  
Es recomendable aplicar el diseño multiplex de FloCMIA, ya  
que en un único acto analítico se puede detectar el componente  
autoinmune en los sueros de pacientes de manera análoga a  
realizar dos determinaciones independientes por el método de  
referencia (mediante el empleo del diseño multiplex se eviden-  
ció mayor número de pacientes con componente autoinmune  
que realizando cada RBA por separado). Esto trae como ventaja:  
I. Potencialmente disminuir los costos para el desarrollo e im-  
plementación de estos métodos en la clínica rutinaria,  
II. Utilizar equipamiento y procedimientos de menor compleji-  
dad,  
6
0
40  
20  
0
GADA  
IA-2A  
IAA  
ZnT8A 4 marcadores FloCMIA  
combinados Multiplex  
Métodos individuales  
Resultados por RBA  
ByPC 2018;82(1):15-27.  
Novedoso inmunoensayo multiplex por Citometría de Flujo para la detección simultánea y discriminativa  
de GADA e IA-2A en pacientes con Diabetes Mellitus  
23  
de importación del insumo. Además, si bien el RBA es un mé-  
todo muy robusto, el trazador radiactivo decae rápidamente  
en el tiempo, afectando de manera negativa la performance  
analítica. Mientras tanto, los métodos FloCMIA dependen de  
con TrxGAD/TrxIA-2ic biotinilada) sumado a una incubación  
entre el suero y el antígeno adsorbido de ≈16 h (cercanía al  
equilibrio), lo que probablemente permitió una unión antíge-  
no-GADA/IA-2A más estable.  
una producción sencilla, rápida y económica de las proteínas IV. La presencia de GADA o IA-2A de baja constante de afinidad  
de fusión necesarias para adsorber a las microesferas.  
En la Figura 7 se re-elaboraron los resultados obtenidos con  
los 48 sueros de pacientes infanto-juveniles con reciente diag-  
nóstico de DMT1. En dicha figura se muestra en forma compara-  
tiva la sensibilidad obtenida para el FloCMIA multiplex respecto  
de los otros marcadores serológicos de autoinmunidad. Como  
(K ) dificulta su detección por RBA ya que es un ensayo que  
detecta muy bajas concentraciones pero es altamente de-  
a
pendiente de la K . Mientras que aquellos ensayos de fase  
a
sólida pueden detectar dichos autoanticuerpos de baja afi-  
nidad, pero presentan grandes limitaciones respecto a su  
sensibilidad [44-46].  
puede observarse, la metodología desarrollada presentó el ma- V. Hay un reconocimiento de epitopes no expuestos original-  
yor porcentaje de positividad dentro del grupo de pacientes dia-  
béticosevaluadosencomparaciónacadaunodelosmétodosin-  
dividuales por radiometría: hasta un 77,1 % de los pacientes con  
diagnóstico reciente de DMT1 presentaron GADA y/o IA-2A por el  
FloCMIA multiplex, un aumento significativo en la sensibilidad  
respecto de los métodos de referencia individuales para GADA,  
IA-2A, IAA y ZnT8A con los cuales se alcanzó una sensibilidad del  
mente en la fase fluida, porque en esta se utiliza el antígeno  
nativo expresado en un organismo eucariota. Esto no siem-  
pre significa que sea la forma en que se presenta al sistema  
inmune y se genera la respuesta inmune dirigida a estos  
autoantígenos, por lo que la forma en que se adsorbe sobre  
una superficie de poliestireno puede exponer epitopes ne-  
cesarios para la unión del autoanticuerpo. Por otro lado, se  
usan dos moléculas estructuralmente diferentes y de dis-  
tinta fuente celular, potencialmente presentando epitopes  
diferencialmente.  
52,1 %, 58,3 %, 12,5 % y 45,8 % respectivamente. Al analizar la  
sensibilidad combinada, la incorporación de los marcadores IAA  
y ZnT8A dosados por RBA sólo aportó un 6,2% extra al porcentaje  
de pacientes con componente autoinmune (83,3% de sensibi- VI. Finalmente, en particular en estos casos, los 2 pacientes  
lidad combinada entre los 4 marcadores vs. 77,1 % detectado  
originalmente con RBA GADA e IA-2A analizados en conjunto).  
De hecho, no es una gran ventaja sobre el componente autoin-  
mune detectado con FloCMIA multiplex ya que en valor absoluto  
evidenciaron componente autoinmune ya sea por presencia  
de IAA o ZnT8A, dándoles un fuerte respaldo experimental a la  
detección del proceso autoinmune.  
Los resultados obtenidos permiten afirmar que el FloCMIA  
se detecta por RBA el proceso autoinmune subyacente en 3 pa- multiplex es útil para el screening de la DMT1 en la población  
cientes más, 2 de ellos GADA (-)/IA-2A (-)/IAA (+)/ZnT8A (-) (uno infanto-juvenil.  
de los cuales resultó GADA (+) por FloCMIA) y 1 de ellos GADA (-)/  
En el futuro se pretende extender el diseño multiplex al resto  
IA-2A (-)/IAA (-)/ZnT8A (+). Por lo tanto, aún teniendo en cuen- de los marcadores humorales de mayor prevalencia, como IAA/  
ta la determinación conjunta de los 4 marcadores humorales PAA y ZnT8A, y así contar con la detección simultánea y discrimi-  
principales, el FloCMIA multiplex aún puede reemplazarlos con nativa de los 4 autoanticuerpos claves en DM autoinmune. De  
una buena performance. Si bien anteriormente nuestro grupo hecho, se puede seleccionar un panel diferencial de analitos a  
de trabajo desarrolló un método combinado para GADA e IA-2A analizar dependiendo de la población en estudio y la prevalencia  
que podía detectar el mismo número de pacientes diabéticos diferencial de los marcadores en las mismas:  
con etiología autoinmune que las determinaciones combinadas I. En pacientes niños y adolescentes sería conveniente estu-  
por RBA [34], este poseía un fundamento radiométrico por lo  
que no era posible su aplicación a un gran número de muestras  
diar GADA e IA-2A en principio para el apoyo diagnóstico en  
casos de debut sospechoso.  
e incluso sus costos no justificaban su aplicación rutinaria. Por II. En jóvenes y adultos no obesos, con comienzo clínico de DM  
otro lado, a diferencia del FloCMIA multiplex, no podía discriminar  
entre marcadores, sólo detectar componente autoinmune. Por  
último, puede observarse en la figura 6 (diagrama de Venn para  
el componente autoinmune) que hay 2 pacientes originalmente  
RBA negativos que “positivizaron” al analizarse por FloCMIA mul-  
tiplex. Se considera que estos hallazgos analíticos no implican la  
aparición de falsos positivos debido a que:  
I. Al debutar con la patología, la clínica de estos pacientes es  
inequívoca para DMT1,  
II. Se acepta actualmente que el RBA por sí solo no es suficiente  
(clasificación como LADA o DMT2 genuino), cobraría mayor  
importancia sumar el uso de ZnT8A o IAA a GADA, no tanto así  
IA-2A ya que se demostró la relación inversa entre sus títulos  
y la edad, y no aportaría aumento en la prevalencia del com-  
ponente autoinmune. Sin embargo, su presencia indicaría alto  
riesgo para la rápida progresión a la insulino-dependencia.  
III. El estudio de los títulos de anticuerpos anti-insulina (IA) pro-  
ducidos por la terapia insulínica sustitutiva para detectar fa-  
lla en el control metabólico de pacientes diabéticos, etc.  
También es útil no sólo para el apoyo diagnóstico (mejor  
para descartar la presencia de autoinmunidad en pacientes clasificación, aplicación terapéutica adecuada en el momento  
diabéticos juveniles [43]. oportuno y máxima preservación funcional de los islotes pan-  
III. El protocolo de FloCMIA combinó interacciones de fase sólida creáticos) sino también para su aplicación en:  
GADA/IA-2A con TrxGAD/TrxIA-2ic inmovilizado) y fase fluida I. Estudios de prevalencia en la población general,  
complejo inmune microesfera- TrxGAD/TrxIA-2 -GADA/IA-2A II. Estudios de predicción en grupos de riesgo (parientes en  
(
(
ic  
ByPC 2018;82(1):15-27.  
24  
Novedoso inmunoensayo multiplex por Citometría de Flujo para la detección simultánea y discriminativa  
de GADA e IA-2A en pacientes con Diabetes Mellitus  
primer grado, sanos, de pacientes con DMT1) aguardando la Referencias bibliográficas  
disponibilidad de terapias preventivas. Aquí sería útil la com- 1. Group IDFDA. Update of mortality attributable to diabetes for  
binatoria GADA/IA-2A,  
III. Prospección de la patología, entre otras.  
the IDF Diabetes Atlas: Estimates for the year 2013. Diabetes  
research and clinical practice. 2015; 109(3):461-5. Epub  
2015/06/30.  
Todas estas aplicaciones son posibles gracias a la posibili-  
dad de evaluar un gran número de muestras en poco tiempo y 2. Palmer JP, Hirsch IB. What’s in a name: latent autoimmune  
con la posibilidad de obtener el resultado para varios marcado-  
res en una determinación (efectuando un ahorro sustancial de  
diabetes of adults, type 1.5, adult-onset, and type 1 diabetes.  
Diabetes care. 2003;26(2):536-8.  
muestra del paciente al evitar 4 determinaciones individuales, 3. Zimmet PZ, Tuomi T, Mackay IR, Rowley MJ, Knowles W, Cohen  
crítico en algunos grupos de pacientes). También es destacable  
el rango dinámico amplio que posee FloCMIA, y si bien actual-  
mente la semicuantificación de los marcadores no tiene una  
aplicación clínica inmediata ya que se busca presencia del mis-  
mo (priorizando la sensibilidad y especificidad), eventualmente  
M, et al. Latent autoimmune diabetes mellitus in adults  
(LADA): the role of antibodies to glutamic acid decarboxylase  
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Medicine : a Journal of the British Diabetic Association.  
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podría correlacionarse con diferentes fenómenos consecuencia 4. Jahromi MM, Eisenbarth GS. Cellular and molecular patho-  
de la patología, como por ejemplo con la cercanía al debut, pro-  
greso del daño pancreático, el requerimiento de insulina [34],  
genesis of type 1A diabetes. Cell Mol Life Sci. 2007;64(7-  
8):865-72.  
entre otras. En este contexto, Achenbach y col. examinaron 5. Reaven GM, Bernstein R, Davis B, Olefsky JM. Nonketotic dia-  
prospectivamente el título de autoanticuerpos, la reactividad  
hacia ciertos epitopes y las subclases de IgG en familiares en  
betes mellitus: insulin deficiency or insulin resistance? The  
American Journal of Medicine. 1976;60(1):80-8.  
primer grado de pacientes diabéticos con presencia de algún 6. DeFronzo R, Deibert D, Hendler R, Felig P, Soman V. Insulin  
autoanticuerpo y determinaron cómo estos análisis pueden ser  
utilizados para estratificar la probabilidad de progresión hacia  
el debut clínico de la DMT1 [47]. De esta manera, demostraron  
sensitivity and insulin binding to monocytes in maturi-  
ty-onset diabetes. The Journal of Clinical Investigation.  
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que el riesgo de DMT1 aumenta en familiares con títulos de IA-2A 7. Turner RC, Holman RR, Matthews D, Hockaday TD, Peto  
e IAA por encima del umbral del percentilo 99 de individuos con-  
troles, pero que el riesgo no se relaciona con los títulos de GADA.  
Como consecuencia de esto, el RBA quedaría como un méto-  
do complementario o confirmatorio para ciertos casos dudosos,  
reemplazado por un método más adecuado para screening rápi-  
J. Insulin deficiency and insulin resistance interaction in  
diabetes: estimation of their relative contribution by fee-  
dback analysis from basal plasma insulin and glucose con-  
centrations. Metabolism: Clinical and Experimental. 1979;  
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do, masivo y económico debido a que es más simple de ejecutar, 8. Olefsky JM, Kolterman OG, Scarlett JA. Insulin action and  
menos costoso, aplicable a la práctica clínica y factible de ser  
automatizado.  
resistance in obesity and noninsulin-dependent type II  
diabetes mellitus. The American Journal of Physiology.  
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Como conclusión se logró desarrollar un inmunoensayo no  
radiométrico basado en citometría de flujo el cual logró tanto la 9. SEARCH for Diabetes in Youth: a multicenter study of the pre-  
mayor sensibilidad analítica en la búsqueda de autoinmunidad  
en DMT1 como el mayor VPP en la evaluación del riesgo a desa-  
rrollar DMT1.  
valence, incidence and classification of diabetes mellitus in  
youth. Controlled clinical trials. 2004;25(5):458-71.  
10. Gepts W. Pathologic anatomy of the pancreas in juvenile dia-  
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Agradecimientos  
11. Eisenbarth GS. Type I diabetes mellitus. A chronic autoimmu-  
ne disease. N Engl J Med. 1986;314(21):1360-8.  
Agradecemos a Liliana Trifone y Adriana Roussos del Servicio  
de Nutrición del Hospital Pediátrico Nacional Gutiérrez y a la Divi- 12. Atkinson MA, Eisenbarth GS, Michels AW. Type 1 diabetes.  
sión de Hemoterapia del Hospital de Clínicas José de San Martín Lancet. 2014;383(9911):69-82.  
(Buenos Aires, Argentina) por recolectar y suministrar el suero 13. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes  
de pacientes diabéticos y de individuos controles normales, res-  
pectivamente.  
Este trabajo fue financiado en parte por los subsidios del  
Programa FONCYT de la Agencia Nacional para la Promoción  
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14. Eisenbarth GS, Jeffrey J. The natural history of type 1A dia-  
betes. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia  
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de la Ciencia y la Tecnología (PICT-2008-0998), el Consejo Na- 15. Rabin DU, Pleasic SM, Palmer-Crocker R, Shapiro JA. Cloning  
cional de Investigación (CONICET) PIP 11220120100256CO y  
la Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina (UBA  
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