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Activación de polimorfonucleares neutrófilos por UDP-Glucosa extracelular  
ARTÍCULO ORIGINAL  
Activación de polimorfonucleares neutrófilos por UDP-  
Glucosa extracelular  
Borda, N.; Carbia, C.; Rabossi, G.; Arcavi, M.; García Gonçalves, L.; Ameneiros, M., Martínez, R.; Lazarowski, A.; Merelli, A.  
Instituto de Investigaciones en Fisiopatología y Bioquímica Clínica (INFIBIOC), Laboratorio de Hematología, Departamento  
de Bioquímica Clínica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA. CABA, Argentina.  
Contacto: Merelli, A.; amerelli2002@yahoo.com.ar  
RESUMEN  
Los nucleótidos purinérgicos extracelulares juegan roles importantes en la señalización celular median-  
te la activación de sus receptores específicos, expresados en la mayoría de las células. El receptor P2Y14  
responde a la señalización por UDP-glucosa extracelular pero no por otros nucleótidos/nucleósidos purinér-  
gicos libres. Si bien, los polimorfonucleares neutrófilos normales presentan altos niveles de transcriptos  
del receptor P2Y14,, su función en dichas células ha sido poco investigada. El objetivo de este trabajo fue  
demostrar si UDP-Glucosa extracelular induce la quimiotaxis y adhesividad de los neutrófilos. Para ello,  
se midió la quimiotaxis en polimorfonucleares neutrófilos de: a) pacientes con leucocitosis y neutrofilia  
(n=10), b) individuos sanos (n=10), c) neutrófilos normales pre-incubados con suero de individuos sanos  
(n=20) y d) neutrófilos normales pre-incubados con suero de pacientes con artritis reumatoidea (n=17). El  
control basal se realizó con neutrófilos preincubados con RPMI. También se ensayó la adhesividad de neu-  
trófilos normales al vidrio. En ambos procedimientos se utilizaron como agonistas, UDP-Glucosa y fMLP. Los  
resultados obtenidos indicaron que, en los grupos a y b los valores de quimiotaxis inducida por fMLP fueron  
similares, mientras que, la inducida por UDP-Glucosa fue superior en el grupo a. En el grupo c, fMLP mostró  
mayor estimulación que UDP-Glucosa, en tanto que, en neutrófilos normales preincubados con suero de  
pacientes con artritis reumatoidea (grupo d) la quimiotaxis inducida por ambos agonistas fue similar. Cabe  
destacar que UDP-Glucosa presentó mayor actividad quimiotáctica en neutrófilos normales preincubados  
con suero de pacientes con artritis reumatoidea, respecto a los preincubados con suero normal. La adhe-  
sividad al vidrio de neutrófilos normales, fue mayor con UDP-Glucosa que con fMLP. En conclusión, estos  
resultados sugieren que la UDP-Glucosa como agonista extracelular, tiene capacidad de generar respuestas  
fisiológicas en los neutrófilos, tales como la activación de la quimiotaxis y la adhesividad, donde la quimio-  
taxis se hace más evidente frente a condiciones inflamatorias previas.  
Palabras clave: PMN, UDP-G, quimiotaxis, P2Y14-R, adhesividad.  
Extracellular purinergic nucleotides play important roles in cell signalling by activating their specific  
receptors expressed in most cells. The P2Y14 receptor responds to extracellular signalling by UDP-glucose  
but not to other free purinergic nucleotides / nucleosides. Normal polymorphonuclear neutrophils have  
high levels of P2Y14-R transcripts. However, the function of these receptors in these cells has been poorly  
investigated. The aim of this study was to demonstrate whether UDP-glucose induces chemotaxis and  
adhesion of neutrophils. For this purpose, we measured chemotaxis in: a) polymorphonuclear neutrophils of  
patients with leukocytosis and neutrophilia (n=10); b) polymorphonuclear neutrophils of healthy individuals  
ABSTRACT  
(n=10); c) normal polymorphonuclear neutrophils pre-incubated with serum from normal individuals (n =  
20); and d) normal polymorphonuclear neutrophils pre-incubated with serum from patients with rheumatoid  
arthritis (n=17). The baseline control was performed with polymorphonuclear neutrophils pre-incubated  
with RPMI. The adhesiveness to glass of polymorphonuclear neutrophils was also tested. UDP-glucose and  
fMLP were used as agonists in both procedures. In a and b, the values of chemotaxis induced with fMLP were  
similar, whereas those induced with UDP-glucose were higher in group a. In group c, fMLP showed greater  
stimulation than UDP-glucose, whereas in group d chemotaxis was similar with both agonists. UDP-glucose  
showed higher chemotactic activity in cells pre-incubated with serum from patients with rheumatoid artritis  
than in cells pre-incubated with normal serum. Adhesiveness to glass of normal neutrophils was higher when  
induced with UDP-glucose than when induced with fMLP. In conclusion, these results suggest that UDP-  
glucose, as extracellular agonist, can induce physiological responses of neutrophils such as chemotaxis and  
adhesiveness, where chemotaxis becomes more evident under previous inflammatory conditions.  
Key words: polymorphonuclear neutrophils, UDP-glucose, chemotaxis, P2Y14-R, adhesiveness.  
ISSN 1515-6761 Ed. Impresa  
ISSN 2250-5903 Ed. CD-ROM  
Código Bibliográfico: RByPC  
Fecha de Recepción:  
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9/08/2014  
Fecha de Aceptación:  
3/03/2015  
.
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ByPC 2015;79(3):10-17.  
Activación de polimorfonucleares neutrófilos por UDP-Glucosa extracelular  
11  
Introducción  
mente estudiados. Conocer los procesos de señalización  
Los polimorfonucleares neutrófilos (PMN) son células que participan en la modulación de su función, puede resul-  
dinámicas móviles que forman parte de los mecanismos de tar de gran importancia en la prevención de la lesión tisular  
defensa contra muchos agentes patógenos. Son los leuco- inducida por neutrófilos infiltrantes y evitar el daño, fallo  
1
1
citos más numerosos presentes en la sangre periférica de o disfunción de órganos . Tras su activación, los PMN cir-  
individuos adultos, siendo su rango normal estándar de 2,0- culantes se marginan en posición adyacente a la pared del  
9
1
7
,0 x 10 / l.  
endotelio vascular, mediante la expresión de moléculas de  
Éstas células tienen la capacidad de fagocitar y destruir adhesión como la P-selectina e integrina, migrando poste-  
1
2
.
una amplia gama de gérmenes patógenos responsables riormente hacia los tejidos, donde sobreviven por 1-2 días  
de la generación de infecciones y también participan en el El PMN tiene la capacidad de detectar la presencia de bajas  
desarrollo del proceso inflamatorio, así como de diferentes concentraciones de compuestos bacterianos que activan  
su migración desde el torrente sanguíneo hacia el sitio de la  
2
, 3  
.
patologías autoinmunes  
Los PMN se producen en la médula ósea (MO), a partir infección, así como, la concentración del agente quimiotác-  
de las células madre hematopoyéticas pluripotenciales, tico suele ser extremadamente baja en las proximidades de  
las que inician un proceso de diferenciación o granulopo- los PMN, por lo tanto, estas células requieren mecanismos  
yesis en respuesta a la estimulación ejercida por distintos especiales para sostener la señal y migrar en dirección del  
factores de crecimiento. Dicho proceso genera elementos gradiente. Aunque el mecanismo de quimiotaxis se ha estu-  
de maduración intermedia que finalmente se diferenciarán diado ampliamente, aún no está totalmente dilucidado. Las  
en neutrófilos, eosinófilos y basófilos periféricos. Los PMN células polarizan la expresión de sus receptores quimiotác-  
circulantes corresponden a las formas más maduras de la ticos para que queden expuestos hacia la dirección de los  
progenie granulicítica-neutrófila, con un diámetro promedio estímulos, lo que permite orientar el movimiento migratorio  
4
,5  
de 12-15 micras, según se puede observar en extendidos de  
sangre periférica (Figura 1: A-F).  
. La mayoría de las moléculas de membrana de los PMN  
y sus mecanismos de interacción con diferentes tipos ce-  
Estas células tienen una vida media muy corta compara- lulares, incluyendo células vasculares, macrófagos, células  
da a otras células hematopoyéticas y mueren mientras ejer- dendríticas, plaquetas, etc., han sido ampliamente descrip-  
1
3
.
cen su función bactericida intratisularmente, para lo cual, tos  
deben diferenciarse y migrar al foco infeccioso o inflamato-  
Una nueva línea de investigaciones, surgida en la últi-  
rio para actuar (migración suicida). Esta particular forma de ma década, ha mostrado la competencia de la señalización  
actuar requiere de varias funciones tales como: adhesión, ejercida por distintos nucleótidos extracelulares sobre la  
migración, degranulación (con liberación de mediadores diferenciación, proliferación y quimiotaxis de células hema-  
de la inflamación y/o enzimas lisosomales), fagocitosis y topoyéticas, a través de sus respectivos receptores (P2X y  
1
4,15  
. A su vez, se demostró que dichos agonistas tam-  
apoptosis.  
Gran parte de la maquinaria molecular necesaria para bién activan la quimiotaxis de los PMN  
P2Y)  
1
6,17  
. Existe cierto  
cada una de estas respuestas de los PMN, se almacenan grado de especificidad en la activación de dichos receptores  
en sus gránulos citoplasmáticos o bien en la membrana purinérgicos, de modo tal que el receptor P2Y2 se activa por  
plasmática 4 . Los neutrófilos forman parte de la respues- ATP o UTP, pero no por UDP . Cuando el neutrófilo detecta  
ta temprana a los estímulos inflamatorios, lo que implica su una señal quimiotáctica (por ejemplo, péptidos bacteria-  
adhesión a la microvasculatura, su posterior migración y re- nos tales como fMLP), distorsiona su superficie y emite un  
tención en el tejido afectado. Una nueva línea de conceptos, pseudópodo hacia la señal quimiotáctica. Esta deforma-  
aún controversiales, acerca de cómo los neutrófilos pueden ción de su membrana plasmática promueve la liberación  
combatir a los microorganismos incluye la posible regula- local de ATP, que autoactiva el receptor P2Y2 presente en  
ción de la función de las enzimas de sus gránulos, mediada el pseudópodo emergente. La liberación de ATP se produce  
por flujos iónicos y la formación de las llamadas “trampas predominantemente en el polo frontal de la célula, donde la  
-8  
18  
9
,10  
extracelulares de neutrófilos (NETs)  
.
formación de pseudópodos ha tenido lugar generando un  
Los mecanismos involucrados en el reclutamiento de nuevo gradiente quimiotáctico (esta vez debido al propio  
neutrófilos hacia los sitios inflamatorios han sido amplia- ATP autoliberado), que permite amplificar la señal iniciada  
Figura 1. Granulopoyesis (A: Mieloblasto; B: Promielocito; C: Mielocito; D: Metamielocito; E: Granulocito en banda; F: PMN).  
A
B
C
D
E
F
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por fMLP. Es importante tener en cuenta que un segundo ser liberadas de la MO por acción de los respectivos factores  
mecanismo de amplificación de la respuesta quimiotáctica estimulantes de colonias; como así también por diferentes  
implica la conversión del ATP liberado a adenosina y la pos- injurias. Recientemente se ha demostrado que UDP-G puede  
terior activación de sus receptores (P2Y y A ) presentes ser liberada al medio extracelular en condiciones de estrés.  
2
3
19  
en los neutrófilos (Figura 2).  
También se ha documentado que UDP-G logra estimular la  
Hasta ahora, sin embargo, son pocos los estudios fun- movilización de células hematopoyéticas progenitoras de  
cionales en los cuales es posible inferir un papel fisiológi- un animal sano, las que inoculadas a un animal aplasiado  
co para otros receptores purinérgicos como P2Y11, P2Y13 (letalmente irradiado), son capaces de repoblar su médula  
2
5
y P2Y14. Este último receptor (P2Y14-R), identificado ósea restituyendo todos los linajes celulares sanguíneos  
.
más recientemente y, tal vez el menos estudiado, es un En función de lo mencionado, sería lógico pensar que la  
receptor metabotrópico. Éste se reconoció inicialmente UDP-G extracelular (UDP-G-e) podría activar o inhibir algu-  
como un receptor que se activa nucleótidos glicosilados, nas funciones de los neutrófilos, tales como la quimiotaxis,  
tales como UDP-glucosa (UDP-G), UDP-galactosa, UDP-N- la migración, o la adhesividad. Es importante destacar que  
acetilglucosamina y ácido UDP-N-glucurónico, exhibiendo la UDP-G puede ser liberada por distintos tipos celulares, ju-  
más alta selectividad entre los receptores purinérgicos para gando un rol protagónico en la señalización como agonista  
2
6
dichos agonistas, y sin afinidad por la adenosina y/o nucleó- externo de sus receptores específicos . Sin embargo, has-  
tidos de uridina 20,21. Si bien el P2Y14 -R ha sido considerado ta el presente, el potencial efecto de este agonista sobre los  
como un receptor de nucleótidos-glicosilados, se ha infor- PMN ha sido escasamente investigado.  
mado que UDP (sin residuos glúcidos) puede ser un anta-  
El objetivo de este trabajo es investigar si la incubación  
de PMN con UDP-G extracelular, posee efectos regulatorios  
2
2
gonista competitivo, o agonista parcial de este receptor  
.
La activación de proteínas G inhibitorias (Gi), promovida sobre la quimiotaxis (QTX) y la adhesión de dichas células,  
por el agonista (UDP-G) y la consecuente inhibición de la y verificar si dichos efectos podrían estar condicionados por  
adenilatociclasa, es considerada una de las principales cas- una situación inflamatoria pre-existente.  
cadas de señalización intracelular disparadas por la excita-  
ción del P2Y14-R, como fue demostrado en distintos tipos Materiales y Métodos  
celulares (HEK-293, glioma C6, células CHO), y muestran Diseño experimental  
2
3
.
una expresión estable de dicho receptor  
Se diseñaron dos tipos de experimentos:  
• Ensayo de QTX en PMN provenientes de:  
a) voluntarios sanos (n = 10)  
A diferencia de otros tipos celulares (células dendríti-  
cas, linfocitos T, células de la médula ósea y astrocitos), los  
PMN tienen una altísima carga de transcriptos (mRNA) del  
b) individuos con leucocitosis (> 12.000 células/ml y  
neutrofilia > 75%) (n = 10)  
• Ensayo de QTX en PMN provenientes de individuos  
normales preincubados con:  
P2Y14-R, siendo 14.000 veces mayor que en los tipos celu-  
lares mencionados 2  
4
.
Las células progenitoras hematopoyéticas están pre-  
sentes en circulación en pequeñas cantidades y pueden  
a) sueros normales (n = 20)  
b) sueros de pacientes con AR (n = 17)  
c) con buffer RPMI-1640 (n = 5)  
En todos los grupos los PMN fueron estimulados con UDP-  
G-extracelular o con fMLP.  
Figura 2. La mayoría de los tejidos son capaces de liberar  
nucleótidos purinérgicos incluyendo la UDP-G, que activan  
suscorrespondientesreceptoresextracelulares.Sepostula  
que la UDP-G, podría tener un efecto quimioatractante  
sobre los PMN.  
Muestras  
En una primera fase la QTX fue ensayada con muestras  
e sangre periférica, extraída a individuos adultos volunta-  
ios normales, y de individuos con leucocitosis (> 12.000  
el/ml y neutrofilia > 75%). En una segunda fase, la QTX fue  
xaminada utilizando PMN de individuos sanos previamen-  
e incubados con: suero normal, suero de pacientes con ar-  
ritis reumatoidea, o RPMI-1640.  
Todos los individuos con AR y los controles normales  
ueron evaluados con los siguientes parámetros de labo-  
atorio: hemograma, eritrosedimentación, PCR cuantitativa  
or métodos convencionales y TNF circulante por técnica de  
uimioluminiscencia (Roche Diagnostics). Los sueros fue-  
on conservados a -20° C hasta la realización de las pruebas  
erológicas.  
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PMN antes obtenida en los pocillos del compartimiento supe-  
rior de la cámara. Ambos compartimientos son separados por  
una membrana de policarbonato con poros de 3 μm (Figura 4).  
La placa fue incubada a 37º C en estufa gaseada (5% CO2)  
por 50 minutos y la suspensión celular de la fase superior fue  
removida, mientras que, cada filtro fue cuidadosamente lavado  
con salina estéril, teñido con May Grumwald-Giemsa y observa-  
do al microscopio (100 X), para la cuantificación de las células  
quimioatraídas (4 campos por filtro). Este resultado se expresa  
como nº de PMN /campo, y también, puede expresarse como el  
recuento total de PMN transmigrados por pocillo (PMN / well).  
Figura 3. a- Esquema de separación celular con Ficoll-  
Hypaque (Izquierda).  
b- Análisis por citometría de flujo: Patrón compatible con  
una población homogénea de PMNs viables. Obsérvese  
en la parte inferior la presencia de una mínima población  
celular posiblemente linfocitaria. Estos datos confirman  
lo obtenido con el equipo automatizado de hemograma.  
c- Histograma. Frequency vs. Forward Scatter que muestra la  
población altamente homogénea.  
1
5
Curva dosis respuesta  
Plasma  
Las pruebas de QTX se ensayaron inmediatamente des-  
pués del aislamiento de los PMN neutrófilos y se realizaron  
las correspondientes curvas dosis-respuesta de UDP-G-e  
Células  
Mononucleares  
Ficoll  
-7 -3  
concentraciones crecientes desde 10 M a 10 M), y de  
-10 -7  
(
Eritrocitos  
y PMN  
FSC-H  
fMLP (concentraciones crecientes desde 10 M a 10 M).  
Las concentraciones óptimas obtenidas fueron de 100  
mM para la UDPG-e y 100 nM para el fMLP, las cuales fueron  
utilizadas en todos los ensayos.  
a
b
c
Aislamiento y caracterización de los PMN  
Los estudios de QTX estimulada con UDP-G-e, fueron rea-  
Los PMN fueron aislados mediante la técnica de separa- lizados en presencia y en ausencia de apirasa (Apyrase 0,5  
ción por gradiente de densidad y centrifugación con Ficoll- UI/ml - Sigma Aldrich Cat No. A6410). La apirasa es una en-  
Hypaque (Figura 3a) 2  
7
.
zima que cataliza la hidrólisis de ATP para dar AMP y fosfato  
La suspensión celular obtenida fue cuantificada utilizan- inorgánico. También puede hidrolizar ADP y otros nucleóti-  
do un contador hematológico automatizado (Sysmex XT- dos (tri o di-fosfatos), y no actúa sobre nucleótidos glico-  
1
800i-Sysmex Corporation, Kobe, Japan). Se alcanzó una silados como UDP-G. El agregado de apirasa en este ensayo  
concentración de PMN del 99% mientras que las células mo- permitió verificar que la activación de la QTX de los PMN fue  
nonucleares no superaron el 0,5%. La viabilidad se testeó debida exclusivamente a UDP-G-e agregado.  
con tinción vital Trypán Blue, y la suspensión fue ajustada a  
una concentración final de 2,5 x 10 cel. /ml.  
6
Ensayo de QTX en muestras de PMN neutrófilos de  
Este procedimiento fue controlado por técnicas de cito- individuos sanos (sin leucocitosis ni neutrofilia )  
metría de flujo para confirmar el linaje celular por paráme-  
tros FSC/SSC (Figura 3b, 3c).  
La QTX de los PMN de 17 individuos sanos, se ensayó con  
UDP-G-e (100 mM), fMLP (100 nM) como control positivo y  
RPMI-1640 como control negativo.  
Ensayo de quimiotaxis  
Se colocaron 130 ml de: a) fMLP (control positivo), b) Ensayo de quimiotaxis en sujetos con leucocitosis  
RPMI-1640 (control negativo) y c) UDP-G, en los correspon-  
La QTX de PMN provenientes de sujetos con leucocitosis  
dientes pocillos del compartimiento inferior de la cámara de (> 12.000 cel / ml y neutrofilia > 75%) se ensayó en las mis-  
Boyden modificada.  
mas condiciones que en el grupo anterior.  
Posteriormente se sembraron 100 ml de la suspensión de  
Figura 4. Esquema de la Cámara de Boyden.  
6
Siembra de 2,5 x 10 PMN/ml  
Dirección  
de la QTX  
membrana  
fMLP; UDP-G; RPMI  
Cámara de Boyden (12 wells)  
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Activación de polimorfonucleares neutrófilos por UDP-Glucosa extracelular  
Ensayo de quimiotaxis de PMN normales pre-incubados leucocitosis y neutrofilia, mostraron diferentes perfiles de in-  
con suero normal y con suero de pacientes con AR  
ducción, ya sea con fMLP o con UDP-G-e, y ambos casos mos-  
Las pruebas de QTX se realizaron empleando los mismos traron diferencias significativas con respeto a los controles con  
métodos antes descriptos, con PMN neutrófilos normales RPMI. La estimulación con fMLP fue indistintamente elevada  
pre-incubados con sueros normales (n= 20) y con sueros frente a los dos tipos de poblaciones leucocitarias, en tanto que  
provenientes de pacientes con artritis reumatoidea (n= 17). la UDP-G-e mostró una fuerte acción inductora, sólo frente a los  
PMN provenientes de muestras con leucocitosis (p < 0,0001)  
Técnica de adhesión  
(Figura 7).  
Se incubaron PMN de individuos sanos, con fMLP, UDP-  
G-e y RPMI 1640. Una alícuota de cada suspensión se colocó Resultados de las determinaciones realizadas en  
sobre un portaobjeto, el cual se incubó 45 minutos en estufa los pacientes con artritis reumatoide  
Ninguno de los pacientes tenía leucopenia ni plaquetopenia,  
(
37º C) gaseada (5% CO ) y fue posteriormente examinado  
2
al microscopio óptico. La suspensión de PMN utilizada fue la y sólo tres de ellos presentaban anemia leve. Los valores de  
misma que en los ensayos de QTX. Se procesaron 4 mues- ERS fueron medianamente elevados (VN: hasta 10-15 mm/1h)  
tras por duplicado.  
en la mayoría de ellos, hecho que no se correlacionó con los  
valores de la PCR cuantitativa (VN: hasta 6 mg/L). El recuento  
leucocitario y el % de PMN resultaron normales en todos los indi-  
Estadística  
Los resultados fueron analizados con INFOSTAT, con prue- viduos. En la tabla I, se detallan los resultados de 3 parámetros  
bas test de t (Figura 6) y de Kruskal Wallis (Figuras 7y 8).  
del hemograma, considerados relevantes para el estudio (Hto,  
Rto. Blancos y % PMN), acompañados de las determinaciones  
complementarias tales como: ERS y PCR cuantitativa (Tabla I).  
Los resultados de TNF fueron en su mayoría bajos, excepto  
Resultados:  
Curvas dosis-respuesta  
Las curvas dosis respuesta con fMLP y con UDP-G-e mos- en tres casos que tenían valores elevados y en los que se cons-  
traron un incremento en la actividad quimiotáctica de los tató una mayor actividad de QTX inducida por UDP-G-e respecto  
PMN provenientes de muestras con leucocitosis y neutro- a la QTX inducida por fMLP. Sin embargo, solamente en el caso  
filia. Las concentraciones de fMLP necesarias para esta es- con valores de TNF de 220 pg/ml, la activación de la QTX con  
timulación resultaron significativamente menores a las de UDP-G-e duplicó el valor observado frente a fMLP (Tabla II).  
UDP-G-e. Las curvas de UDP-G-e con y sin apirasa, no mos-  
traron diferencias significativas (Figura 5 y 6).  
QTX de PMN normales, preincubados con suero  
normal o suero de pacientes con AR  
QTX de PMN con o sin leucocitosis / neutrofilia  
La QTX de PMN normales previamente enfrentados con  
La activación de la quimiotaxis utilizando PMN provenientes sueros normales, fue mayor cuando se indujo con fMLP que  
de individuos normales (sin leucocitosis) y de individuos con con UDP-G-e y RPMI. En cambio, la QTX de los PMN normales  
Figura 5. Curva dosis respuesta de la QTX inducida con  
fMLP de PMN provenientes de individuos con leucocito-  
sis y neutrofilia. Las microfotografías corresponden a  
las dosis mínimas y máximas de fMLP aplicadas respec-  
tivamente. Los ensayos con PMNs de individuos norma-  
les mostraron resultados similares.  
Figura 6. Curva dosis respuesta de la QTX inducida con UDP-G  
de PMN provenientes de individuos con leucocitosis en pre-  
sencia () o en ausencia () de apirasa. Las microfotogra-  
fías corresponden a dosis mínimas y máximas de UDPG (sin  
apirasa). Las dosis resultaron en un rango de 3 logaritmos de  
concentración superiores a las utilizadas con fMLP.  
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Figura 7. Quimiotaxis: valores promedio de recuento de  
Figura 8. QTX de PMN de controles normales, incubados  
PMN migrados según cada tratamiento. Análisis esta-  
pre-incubados con sueros de pacientes con artritis, mostró 
que la inducción con fMLP se redujo respecto al grupo anterior. fMLP y UDP-G-e  
A su vez, la inducción con UDP-G-e en presencia de suero de  
La técnica de adhesividad mostró que tanto fMLP como  
pacientes con artritis, fue significativamente superior a la del UDP-G-e favorecen la adhesividad de los PMN normales al  
grupo anterior, igualando los valores obtenidos con fMLP en las vidrio respecto al control con RPMI,, siendo mayor con UDP-  
mismas condiciones. Si bien la QTX inducida por UDP-G-e fue li- G-e que con fMLP (Figura 9).  
geramente positiva frente al suero normal, dicha actividad no  
se diferenció de los controles con RPMI. Sin embargo, cuando Discusión  
los PMN normales fueron enfrentados al pool de sueros con AR,  
Los resultados obtenidos sugieren que la activación de  
la QTX inducida por UDPG-e se incrementó significativamente la quimiotaxis de PMN mediada por la acción de UDP-G ex-  
respecto al mismo control con RPMI (p < 0,001). Cabe destacar tracelular sería un proceso condicionado por una situación  
que en ausencia de suero, sólo fMLP activó la QTX (Figura 8).  
Tabla II. Valores de TNFα (pg/ml), y cantidad total de  
PMN migrados con cada agonista.  
Tabla I. Valores de los parámetros de laboratorio de los  
pacientes con artritis reumatoidea.  
Paciente TNF (pg/ml) QTX-fMLP QTX-UDP-G  
QTX-RPMI  
420  
289  
330  
380  
410  
298  
321  
368  
452  
466  
389  
375  
299  
350  
620  
278  
420  
380  
1
2
3
4
5
6
7
8
9
12.4  
11.5  
27.9  
44.4  
5.2  
220  
13.2  
12.8  
104  
26.1  
9.6  
10.3  
6.9  
3.8  
5.7  
4.3  
1025  
1277  
1302  
980  
876  
1034  
987  
1276  
1305  
799  
788  
890  
798  
1070  
760  
2056  
863  
970  
1586  
687  
746  
852  
796  
669  
784  
812  
915  
943  
Paciente  
Hto (%) Rto. Blancos %PMN Eritro PCR mg/l  
1
2
3
4
5
6
7
8
9
45  
39  
40  
41  
34  
35  
36  
38  
41  
40  
43  
43  
36  
44  
38  
33  
38  
4.900  
8.800  
7.700  
6.500  
6.200  
9.300  
4.500  
6.000  
6.900  
7.200  
5.200  
6.700  
8.200  
10.000  
5.100  
5.400  
7.800  
53  
74  
49  
53  
59  
64  
68  
64  
48  
73  
55  
60  
66  
66  
60  
59  
66  
2
<0,10  
4,22  
0,67  
0,18  
0,52  
0,93  
0,15  
0,24  
<0,10  
1,33  
0,22  
<0,10  
0,84  
0,23  
0,15  
0,13  
3,72  
31  
42  
19  
53  
48  
20  
23  
18  
42  
10  
30  
31  
32  
30  
21  
56  
1
0
1
2
3
4
5
6
7
1
1
1
1
1
1
1
965  
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
2
3
4
5
6
7
1206  
1177  
698  
886  
1054  
1138  
1057  
8.2  
162  
Promedio  
Hto: Heatocrito; PMN: Polimorfonucleares; PCR: Proteína C TNF: Factor de Necrosis Tumoral; QTX: Quimitaxs; fMLP: for-  
Reactiva  
mil-Metil-Leucin-Fenilalanina; RPMI: Buffer  
ByPC 2015;79(3):10-17.  
16  
Activación de polimorfonucleares neutrófilos por UDP-Glucosa extracelular  
Por su parte, en las pruebas de adhesividad realizadas  
Figura 9. Ensayo de adhesividad (vista microscópica 10X).  
solamente con PMN normales, se observó que UDP-G-e, ad-  
ministrada a idénticas concentraciones que en los ensayos  
de QTX, dio resultados positivos y fue más efectiva que el  
fMLP (Figura 9).  
La UDP-G como agonista extracelular, tiene capacidad de  
generar respuestas fisiológicas en los PMN, tales como la  
activación de la QTX y la adhesividad, donde la QTX se hace  
más evidente frente a condiciones inflamatorias previas.  
Agradecimientos  
Al Dr Eduardo Lazarowski (Cystic Fibrosis/Pulmonary  
Research & Treatment Center-University of North Carolina-  
Chapel Hill) por su apoyo científico y bibiográfico. Los pre-  
sentes resultados fueron financiados con subsidios UBACyT  
B415- y UBACyT-CB02.  
inflamatoria pre-existente (Figuras 7 y 8).  
El dato más significativo fue que la QTX de neutrófilos nor-  
males inducida por UDP-G-e, no sólo fue positiva frente a sue-  
ro normal, sino que se incrementó cuando dichos PMN norma-  
les fueron previamente enfrentados con sueros de pacientes  
con AR, sugiriendo que la presencia de un factor inflamatorio,  
puede ser una condición “necesaria” para la adecuada acción  
de la UDP-G-e sobre los receptores P2Y14 presentes en los  
PMN. A su vez, estos datos confirman los resultados de los  
primeros experimentos realizados con PMN provenientes de  
individuos con leucocitosis y neutrofilia.  
Efectivamente, la QTX inducida en PMN normales prein-  
cubados con sueros de pacientes con AR, fue mayor con  
fMLP que con UDP-G-e, pero ambos, fueron superiores a los  
valores basales obtenidos con RPMI.  
Sin embargo, llamativamente, en los tres casos que pre-  
sentaban niveles altos de TNF en suero, la activación de la  
QTX por UDP-G-e superó a la inducida por fMLP.  
Es interesante mostrar que la QTX inducida por fMLP es  
mayor en PMN preincubados con suero normal respecto a  
los preincubados con suero con AR, y a la inversa, la QTX in-  
ducida por UDP-G-e, parece ser menor frente a suero normal  
que frente a suero con AR. Cabe destacar, además, que a di-  
ferencia de lo que ocurre con fMLP en ausencia de ambos  
sueros (normal o con AR), y ante la sola presencia de buffer,  
la UDP-G-e no activó en forma significativa la QTX de los PMN.  
Estos resultados nos sugieren que un eventual factor, parti-  
cularmente inflamatorio presente en el suero, podría actuar  
como un facilitador de dicha inducción. Recientemente se  
ha descripto que las condiciones inflamatorias incrementan  
Referencias bibliográficas  
1
.
John V Dacie and SM Lewis. Chapter 2. References ran-  
ge s and normal values. En: Practical Hematology (Eight  
Edition). Pp 9-19; Eight Edition. Ed. Churchill Livingsto-  
ne ISBN 0443-049319, 1995.  
2
3
4
.
.
.
Nathan C. Neutrophils and immunity: challenges and  
opportunities. Nat. Rev. Immunol. 2006; 6: 173–182.  
Németh T, Mócsai A. The role of neutrophils in autoim-  
mune diseases. Immunol. Lett. 2012; 143: 9–19.  
Ley K, Laudanna C., Cybulsky MI, Nourshargh S. Getting  
to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cas-  
cade updated. Nat. Rev. Immunol. 2007; 7: 678–689.  
Nourshargh S, Hordijk PL, Sixt M. Breaching multiple ba-  
rriers: leukocyte motility through venular walls and the  
interstitium. Nat. Rev. Mol. Cell Biol 2010; 11: 366–378.  
Borregaard N. Neutrophils, from marrow to microbes.  
Immunity 2010; 33: 657–670.  
5
.
6
7
.
.
Borregaard N, Sørensen OE, Theilgaard-Mönch K. Neu-  
trophil granules: a library of innate immunity proteins.  
Trends Immunol. 2007; 28: 340-345.  
8
9
.
.
Witko-Sarsat V, Rieu P, Descamps-Latscha B, Lesavre  
P, Halbwachs-Mecarelli L. Neutrophils: molecules,  
functions and pathophysiological aspects. Lab Invest  
2000; 80(5):617–653.  
Reeves EP, Lu H, Jacobs HL. Killing activity of neutro-  
phils is mediated through activation of proteases by K+  
flux. Nature 2002; 416: 291–297.  
2
8
la liberación de ATP por el epitelio bronquial . Por lo tan-  
to, se especuló con la posibilidad de que este mecanismo  
podría extenderse a la liberación de UDP-G  
2
9,30  
, y a su vez  
incrementar la susceptibilidad quimiotáctica de los PMN en  
dicho tejido31,32  
10. Brinkmann V, Reichard U, Goosmann C, Fauler B, Uhle-  
mann Y, Weiss DS, Weinrauch Y, Zychlinsky A. Neutro-  
phil extracellular traps kill bacteria. Science 2004.  
303:1532–1535.  
.
Similarmente a lo descrito con el ATP, el incremento en  
la liberación de UDP-G ha sido asociado con la secreción de  
3
3
muscina desde las “Goblet Cells” del pulmón . Es de notar  
que, altas concentraciones de UDP-G capaces de activar el  
receptor P2Y14, son detectadas en las secreciones bron-  
quiales de pacientes con enfermedad fibroquística, una pa-  
tología crónica caracterizada por la progresiva metaplasia  
de las “Goblet Cells”, acumulación de mucus e infiltración de  
1
1. Al-Omari M, Korenbaum E, Ballmaier M, Lehmann U, Jo-  
nigk D, Manstein DJ, Welte T, Mahadeva R, Janciauskie-  
ne S. The acute phase protein, α1-antitrypsin, inhibits  
neutrophil calpain I and induces random migration. Mol  
Med. 2011;17: 865-874.  
34  
12. Pillay J, den Braber I, Vrisekoop N, Kwast LM, de Boer RJ,  
PMN a nivel pulmonar  
.
ByPC 2015;79(3):10-17.  
Activación de polimorfonucleares neutrófilos por UDP-Glucosa extracelular  
17  
Borghans JA, Tesselaar K, Koenderman L. In vivo labe-  
ling with 2H2O reveals a human neutrophil lifespan of  
expressed on brain glia an peripheral inmune cells, is re-  
gulated by immunologic challenge: posible role in neu-  
roimmune function. Molecular Brain Research 2003;  
118:10-23.  
5.4 days Blood. 2010; 116(4):625-627.  
1
1
3. Mócsai A. Diverse novel functions of neutrophils in  
immunity, inflammation, and beyond. J. Exp. Med.  
25. Kook S, Cho J, Lee SB, Lee B-Ch. The nucleotide sugar  
UDP-glucose mobilizes long-term repopulating primitive  
hematopoietic cells. J Clin Invest. 2013; 123(8):3420–  
3435.  
2013;210,7:1283-1299.  
4. Di Virgilio, F., Chiozzi, P., Ferrari, D., Falzoni S, Sanz, JM.,  
Morelli A., Torboli, M., Bolognesi, G., Baricordi OR. Nucleo-  
tide receptors: an emerging family of regulatory mole- 26. Lazarowski E, Shea DA, Boucher RC, Harden TK. Release  
cules in blood cells. Blood. 2001; 97(3):587–600.  
5. Sak K, Boeynaems JM, Everaus H. Involvement of P2Y  
of cellular UDP-glucose as a potential extracellular sig-  
naling molecule. Mol Pharmacol 2003; 63,1190–1197.  
1
receptors in the differentiation of haematopoietic cells. 27. Clark RA and Nausees WM. Isolation and functio-  
J Leukoc Biol. 2003; 73(4):442–447.  
6. Linden J. Cell biology. Purinergic chemotaxis. Science.  
nal analysis of neutrophils. In Current Protocols in  
Immunology. Coligan JE. Krusibeek AM. Margulies DH.  
Shevach EM and Strober W. Editors: John Wiley & Sons,  
New York. 7. 23.1-7.23.3. 1991.  
1
1
2006;314(5806):1689–1690.  
7. Rossi L, Manfredini R, Bertolini F, Ferrari D, Fogli M, Zini  
R, Salati S, Salvestrini V, Gulinelli S, Adinolfi E, Ferrari S, 28. Okada SF, Ribeiro CM, Sesma JI, Seminario-Vidal L, Ab-  
Di Virgilio F, Baccarani M, Lemoli RM. The extracellular  
nucleotide UTP is a potent inducer of hematopoietic  
stem cell migration. Blood. 2007; 109(2):533–542.  
8. Wang S, Voisin MB, Larbi KY, Dangerfield J, Scheier-  
mann C, Tran M, Maxwell PH, Sorokin L, Nourshargh  
S. Venular basement membranes contain specific  
matrix protein low expression regions that act as exit  
points for emigrating neutrophils. J.Exp.Med 2006;  
dullah LH, van Heusden C, Lazarowski ER, Boucher RC.  
Inflammation promotes airway epithelial ATP release  
via calcium-dependent vesicular pathways. Am J Respir  
Cell Mol Biol. 2013; 49(5):814-820.  
1
29. Kreda SM, Okada SF, van Heusden CA, O’Neal W, Gabriel S,  
Abdullah L, Davis CW, Boucher RC, Lazarowski ER. Coor-  
dinated release of nucleotides and mucin from human  
airway epithelial Calu-3 cells. J Physiol 2007;584:245–  
259.  
203:1519–1532.  
1
2
9. Chen Y, Corriden R, Inoue Y, Yip L, Hashiguchi N,  
Zinkernagel A, Nizet V, Insel PA, Junger WG. ATP release  
30. Lazarowski ER, Shea DA, Boucher RC, Harden TK. Relea-  
se of cellular UDP-glucose as a potential extracellular  
signaling molecule. Mol Pharmacol 2003;63:1190–  
1197.  
guides neutrophil chemotaxis via P Y and A recep-  
2
2
3
tors. Science 2006; 314:1792-1795.  
0. Chambers JK1, Macdonald LE, Sarau HM, Ames RS, 31. Sesma JI, Kreda SM, Steinckwich-Besancon N, Dang  
Freeman K, Foley JJ, Zhu Y, McLaughlin MM, Murdock  
P, McMillan L, Trill J, Swift A, Aiyar N, Taylor P, Vawter L,  
Naheed S, Szekeres P, Hervieu G, Scott C, Watson JM,  
Murphy AJ, Duzic E, Klein C, Bergsma DJ, Wilson S, Livi  
H, García-Mata R, Harden TK, Lazarowski ER. The UDP-  
sugar-sensing P2Y14 receptor promotes Rho-mediated  
signaling and chemotaxis in human neutrophils. Am J  
Physiol Cell Physiol. 2012; 303 (5):C490-498.  
GP. A G protein-coupled receptor for UDP-glucose. J Biol 32. Barrett MO, Sesma JI, Ball CB, Jayasekara PS, Jacobson  
Chem 2000; 275:10767-10771.  
KA, Lazarowski ER, Harden TK A selective high-affinity  
antagonist of the P2Y14 receptor inhibits UDP-glucose-  
stimulated chemotaxis of human neutrophils. Mol Phar-  
macol 2013;84(1):41-49.  
2
2
1. Freeman K, Tsui P, Moore D, Emson PC, Vawter L, Naheed  
S, Lane P, Bawagan H, Herrity N, Murphy K, Sarau HM,  
Ames RS, Wilson S, Livi GP, Chambers JK. Cloning,  
pharmacology, and tissue distribution of G-protein- 33. Okada SF, Zhang L, Kreda SM, Abdullah LH, Davis  
coupled receptor GPR105 (KIAA0001) rodent orthologs.  
Genomics. 2001; 78(3):124-128.  
CW, Pickles RJ, Lazarowski ER, Boucher RC. Coupled  
nucleotide and mucin hypersecretion from goblet cell  
metaplastic human airway epithelium. Am J Respir Cell  
Mol Biol 2011;45:253–260.  
2. Carter RL, Fricks IP, Barrett MO, Burianek LE, Zhou  
Y, Ko H, Das A, Jacobson KA, Lazarowski ER, Harden  
TK.Quantification of Gi-Mediated Inhibition of Adenylyl 34 Sesma JI, Esther CR Jr, Kreda SM, Jones L, O’Neal W,  
Cyclase Activity Reveals That UDP Is a Potent Agonist  
of the Human P2Y14 Receptor. Mol Pharmacol  
Nishihara S, Nicholas RA, Lazarowski ER. ER/golgi nu-  
cleotide sugar transporters contribute to the cellular  
release of UDPsugar signaling molecules. J Biol Chem  
2009;284:12572–12583.  
2009:76:1341–1348.  
2
2
3. Fricks I, Carter R, Lazarowski E, Harden K. Gi-Dependent  
Cell Signaling Responses of the Human P2Y14 Receptor  
in Model Cell Systems. JPET 2009,330: 162–168.  
4. Moore DJ, Murdock PR, Watson JM, Faull RL, Waldvogel  
HJ, Szekeres PG, Wilson S, Freeman KB, Emson PC.  
GPR105, a novel Gi/o-coupled UDP–glucose receptor  
ByPC 2015;79(3):10-17.