Cárdenas y col. Paralelismo en inmunoensayos: dos abordajes aplicados a la determinación de anticuerpos anti-péptido deaminado de gliadina 19  
ARTÍCULO ORIGINAL  
Paralelismo en inmunoensayos: dos abordajes aplicados a la determinación  
de anticuerpos anti-péptido deaminado de gliadina  
Parallelism in immunoassays: two approaches applied to the determination of anti-deamidated gliadin  
peptide antibodies  
Cárdenas Delgado, Víctor Manuel1,2*; Nuñez, Myriam3  
1
Sección de Virología y Autoinmunidad, Laboratorio Mantel. Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.  
2
Cátedra de Fisiología Humana, Facultad de Medicina. Fundación Barceló. Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.  
3
Cátedra de Matemática, Departamento de Fisicomatemática, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires. Ciudad Autónoma de Bue-  
nos Aires, Argentina.  
*Contacto: Cárdenas Delgado, Víctor Manuel. Sección de Virología y Autoinmunidad, Laboratorio Mantel, Marcelo T. de Alvear 2263 CP 1122, Ciudad Autóno-  
ma de Buenos Aires, Argentina; victor.cardenas@manlab.com.ar  
Resumen Introducción: el análisis de paralelismo en un ensayo de ELISA examina si los calibradores se comportan como el analito  
endógeno frente a los inmunorreactantes del kit. Si la reactividad es comparable, es válida su aplicación con fines semicu-  
antitativos en el área diagnóstica. Objetivo: analizar el paralelismo entre dos inmunoensayos comerciales ELISA como parte  
de un programa de verificación operativa para determinación de anticuerpos anti - péptido deaminado de gliadina de clase  
IgA e IgG (PDG-A y PDG-G). Materiales y métodos: se procesaron cuatro muestras: M1 a M4. Para el análisis del paralelismo  
entre 1) muestras y estándares y 2) muestras entre sí, se emplearon dos estrategias: en la primera, se ajustó un modelo  
logístico de 4 parámetros (4PL) a muestras y estándares para después linealizar los datos con la transformación Logit - Log.  
Luego, se comparó la similitud entre el coeficiente de Hill y la pendiente de las rectas por ANOVA. En el segundo enfoque,  
basado sobre el coeficiente de variación (CV), se analizó el paralelismo entre muestras. Usando diluciones seriadas de cada  
muestra, se interpolaron las densidades ópticas en la curva de calibración y se corrigió por factor de dilución: el nivel de anti-  
cuerpos obtenido debería ser consistente en el rango de diluciones explorado y no exhibir desviaciones por fuera de valores  
prefijados para un CV de 20 %. Resultados: los dos abordajes fueron congruentes, M1 no reacciona de manera predecible con  
el kit PDG-A, mientras que M3 tampoco lo hace con el kit PDG-G. El análisis de las pendientes parece mostrar una sensibilidad  
exagerada en la detección de desvíos del paralelismo. Conclusiones: se recomienda dar prioridad a la evaluación gráfica de  
las curvas 4PL y abandonar el uso de las pruebas basadas sobre la hipótesis de similitud de parámetros en favor del método  
basado sobre el CV%.  
Palabras clave: ELISA, inmunoensayo, paralelismo, diagnóstico, estándares.  
Abstract Introduction: Parallelism analysis examines whether the calibrators behave in the same manner as the endogenous analyte  
against the immunoreactants kit. Once confirmed, the kit can be applied for semiquantitative purposes in the diagnostic field.  
Objectives: To analyze ELISAs parallelism as part of an operative verification program of two commercial immunoassays that  
quantitate anti-deamidated gliadin peptide antibodies of IgA and IgG class (DGP-A and DGP-G). Materials and methods: Four  
human samples termed M1 to M4 were processed. To analyze parallelism between samples and standards, a logistic four-  
parameter model (4PL) was adjusted to samples and standards, and then the data were linearized with the aid of Logit-Log  
transformation. ANOVA was used to compare the similarity between Hill coefficient (4PL) and slopes (linear adjustment). Then,  
to analyze parallelism among samples, we used an approach based on the variation coefficient (VC %). By processing serial dilu-  
tions of each sample, optical densities were interpolated in the calibration curve and the resulting concentrations were dilution-  
corrected. Antibody levels obtained from this inverse procedure should remain consistent in the dilution range explored, without  
deviations from the tolerable VC% value. Results: Both approaches agreed in that M1 did not react in a predictable fashion with  
the DGP-A kit. The same conclusion was drawn from M3 analysis with the DGP-G kit. Slope analysis showed an exaggerated sen-  
sitivity when detecting parallelism deviations. Conclusions: It is recommended to prioritize graphical evaluation of 4PL curves  
and set aside the parameter similarity-based tests in favor of the VC%-based method.  
Keywords: ELISA, immunoassay, diagnostics, parallelism, standards.  
IISSN 1515-6761  
ISSN-e 2684-0359  
Código bibl.: ByPC  
Recibido: 07/10/2019  
Aceptado 21/04/2020  
ByPC may-ago 2021; 85(2): 19-26 // ISSN-e 2684-0359  
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Cárdenas y col. Paralelismo en inmunoensayos: dos abordajes aplicados a la determinación de anticuerpos anti-péptido deaminado de gliadina  
Introducción  
la curva de calibración no sólo son heterogéneos en cuanto  
La técnica de ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas a su composición, sino que, muchas veces, están insufici-  
(
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA), de uso tan entemente caracterizados en los certificados de análisis que  
extendido en el campo de la serología, brinda una estimación acompañan los kits comerciales. Otros niveles de complejidad  
semicuantitativa de biomarcadores de importancia clínica. se suman a la cuestión, si se considera la respuesta humoral  
Dentro de la esfera de estos biomarcadores, se encuentran los inmadura de pacientes pediátricos, tal vez no comparable a la  
anticuerpos con especificidad de unión definida cuyos niveles de adultos, y su potencial impacto en la señal. Por lo expuesto,  
circulantes correlacionan con eventos fisiopatológicos, tales cabe la posibilidad de que el material de referencia de los ELISA  
como inmunizaciones, procesos infecciosos o recidivas en en- no sea representativo del analito endógeno desde el punto  
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fermedades autoinmunes. Así, su determinación se ha consa- de vista inmunoquímico. Esto cuestiona la noción según la  
grado como una valiosa herramienta para los procesos de toma cual es válido interpolar señales en la curva estándar con fines  
de decisiones inscriptos en el marco de complejos algoritmos semicuantitativos y, por lo tanto, también pone en duda la cali-  
de la práctica clínica. En este contexto, desde el laboratorio de dad de los resultados analíticos derivados del ensayo.  
inmunología es esencial contar con procedimientos que no  
El análisis de paralelismo aborda estas cuestiones al exami-  
sólo den certeza acerca del desempeño de los inmunoensayos nar si los calibradores mimetizan el comportamiento del analito  
disponibles comercialmente, sino que, además, definan sus endógeno frente a los inmunorreactantes del kit. Si la reactivi-  
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limitaciones. En este artículo se plantea un esquema de veri- dad es comparable, las curvas dosis -respuesta del analito y del  
ficación operativa del paralelismo aplicado a dos inmunoen- estándar difieren únicamente en un desplazamiento horizon-  
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sayos comerciales para detección de anticuerpos anti-péptido tal y es válida la aplicación del kit con fines semicuantitativos.  
deaminado de gliadina de clase IgA e IgG (PDG-A y -G), de uso Pese al reconocimiento de su importancia crítica en etapas pre-  
corriente en el laboratorio clínico.  
coces del desarrollo de las técnicas de ELISA, hay discrepancia  
Hay una creciente demanda analítica sobre las determina- en la literatura en lo referido a la manera de conducir los experi-  
ciones que integran el panel de pruebas diagnósticas de en- mentos de paralelismo y a cuáles deberían ser los criterios de  
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fermedad celíaca: su elevada prevalencia, estimada en el 1 % aceptación o rechazo de un inmunoensayo diagnóstico.  
de la población, sumada a iniciativas de organizaciones civiles En este artículo, se plantea un esquema de verificación  
para que se legisle sobre la materia justifica la trascendencia operativa del paralelismo aplicado a dos inmunoensayos co-  
sanitaria que ha cobrado la detección precoz en individuos de merciales para detección de anticuerpos contra los péptidos  
alto riesgo. Dentro de las pruebas serológicas disponibles, se de gliadina desaminados, anti-PDG de clase IgA y anti-PDG de  
recomienda realizar el cribado por medio de la detección de clase IgG. El análisis se articula en torno a dos enfoques: en  
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anticuerpos antitransglutaminasa y antiendomisio , combi- primer lugar, aquel basado sobre las pruebas de significancia  
nación que por su especificidad y sensibilidad ha probado ser dependientes del valor p aplicado a parámetros derivados de  
eficiente en la tarea de diferenciar a la población afectada por ajustes de regresión tanto lineal como no lineal y, en segundo  
enfermedad celíaca de la población normal. Sin embargo, estos lugar, a una evaluación de la variabilidad en los resultados del  
anticuerpos de buen desempeño en diagnóstico no son adec- cálculo inverso de niveles de analito contra un valor prefijado  
uados para monitorear la adherencia estricta del paciente a la (CV = 20 %). Se analiza la congruencia entre estos abordajes al-  
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dieta libre de gluten , condición necesaria para minimizar el ternativos y se sugieren lineamientos para que, dado el caso, el  
riesgo de mortalidad a largo plazo derivada de complicaciones profesional bioquímico implemente desde una postura crítica  
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oncológicas tales como el linfoma . No obstante, en los últimos su propio programa de verificación de este importante aspecto  
años, la determinación de los niveles de anticuerpos PDG-A y de los inmunoensayos en fase sólida.  
-G por ELISA ha demostrado tener una sensibilidad superior a  
los anticuerpos anti-transglutaminasa tisular y antigliadina en Materiales y métodos  
la detección de transgresiones alimentarias en la población  
pediátrica , lo que justifica su incorporación como herramienta en primer lugar, se examinó el paralelismo entre muestras y  
Se siguieron dos abordajes para el estudio del paralelismo:  
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de monitoreo en numerosos servicios de inmunoserología.  
calibradores empleando una prueba ANOVA para evaluar si-  
La magnitud de la señal analítica en el ELISA depende de la militud de parámetros entre curvas dosis - respuesta. En este  
reactividad del analito con componentes críticos del kit. En con- esquema de trabajo, se analizan parámetros descriptivos de  
traste con métodos cuantitativos de uso corriente en química los ajustes efectuados sobre la distribución de datos de las  
clínica, esta señal no constituye una determinación directa de muestras y los estándares. Una vez comprobado que no difi-  
su masa, sino que depende de características de, por lo menos, eren significativamente, se puede asumir que se cumple la  
una reacción antígeno-anticuerpo. Sabiendo que el analito está condición de paralelismo entre las curvas.  
conformado por una población de anticuerpos cuya biosíntesis  
El segundo enfoque indaga en el fenómeno de paralel-  
deriva de una respuesta inmune humoral de naturaleza poli- ismo entre muestras, siguiendo un procedimiento en el que,  
clonal, es preciso reconocer el alto grado de heterogeneidad en además, se examina la selectividad del ensayo y efecto de po-  
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sus parámetros de interacción inmunoquímicos.  
tenciales interferentes de la matriz. Se parte, en este caso,  
Por otro lado, los estándares que se usan para construir de la premisa según la cual en toda técnica inmunoquímica la  
ByPC may-ago 2021; 85(2): 19-26 // ISSN-e 2684-0359